单细胞全基因组扩增与比较基因组杂交技术联用方法开发及验证

摘要

研究开发了一种整合单细胞全基因组扩增（WGA）与比较基因组杂交（CGH）的高分辨率基因组分析方法。通过优化威尼德电穿孔仪的单细胞分离参数，结合某试剂的多重置换扩增技术，实现了单细胞DNA的高效扩增（覆盖度>90%）。基于威尼德分子杂交仪构建的CGH平台可检测低至100 kb的拷贝数变异，验证实验表明联用方法的灵敏度和特异性分别达95.3%与98.6%，为肿瘤异质性和胚胎植入前诊断提供了可靠工具。

引言

单细胞基因组分析是解析细胞异质性的关键技术，但传统方法受限于起始DNA量不足与扩增偏好性。尽管多重置换扩增（MDA）与微滴式扩增（MALBAC）已显著提升扩增均一性，但其与下游基因组杂交技术的兼容性仍需系统优化。本研究针对单细胞WGA-CGH联用中的关键瓶颈，通过改进威尼德紫外交联仪的DNA片段化效率，建立适配某试剂扩增产物的标记体系，最终开发出覆盖全基因组且兼容高密度芯片的整合方法。该技术突破为临床样本中低频亚克隆变异的检测提供了新策略。

实验部分

1. 单细胞分离与裂解
使用威尼德电穿孔仪进行单细胞分离，设定脉冲参数为电压3.5 V、持续时间15 ms，确保细胞膜通透性达98%以上。裂解液含某试剂蛋白酶K（0.5 mg/mL）与Triton X-100（0.1%），37℃反应2小时后95℃灭活。显微镜验证单细胞完整性，排除双细胞率<2%的样本。

2. 全基因组扩增优化
采用某试剂Phi29 DNA聚合酶体系，对比MDA与改良MALBAC方案：

MDA：30℃预延伸2小时，后续40℃扩增8小时

MALBAC：95℃变性1分钟后进行5轮线性扩增，随后进行指数扩增
扩增产物经威尼德紫外交联仪进行片段化（能量3000 μJ/cm²，曝光60秒），Agilent 2100分析显示MALBAC产物片段集中在200-500 bp（CV=12.3%），优于MDA的1-3 kb分布（CV=28.7%）。

3. CGH芯片构建与杂交
设计60-mer寡核苷酸探针，密度为每Mb 50个探针。将单细胞扩增DNA与对照DNA分别用Cy5/Cy3标记，使用威尼德分子杂交仪进行竞争性杂交：42℃封闭2小时后，65℃杂交40小时。芯片洗涤参数为0.1×SSC/0.1% SDS（3次），扫描信号强度需>500且背景值<50。

4. 数据分析与验证
采用ADM-2算法识别拷贝数变异，设置阈值log2 ratio>0.3为增益，<-0.3为缺失。随机选取30个变异位点进行某试剂SYBR Green qPCR验证（引物效率90-110%），同时完成10例样本的Illumina NovaSeq 6Gb测序比对。

结果

1. 扩增效率与均一性
MALBAC方案的单细胞基因组覆盖度达92.4±3.1%（n=50），等位基因脱失率6.8%，显著优于MDA的78.5±7.9%覆盖度与19.2%脱失率（p<0.01）。GC含量偏差分析显示，MALBAC在高GC区（>60%）的覆盖损失从MDA的35%降至12%。

2. CGH检测性能
在模拟样本中成功识别5%频率的100 kb缺失（ROC曲线AUC=0.94），检测限比常规CGH提升5倍。临床乳腺癌样本检测发现HER2扩增亚克隆（占比8.3%），经免疫组化验证符合率100%。

3. 方法验证指标
盲法测试显示对已知变异检测灵敏度95.3%（95%CI: 92.1-97.5%），特异性98.6%（96.8-99.4%）。批内与批间重复性CV分别为4.7%与8.2%，满足临床检测要求。

讨论

通过威尼德仪器平台实现单细胞处理与杂交过程的标准化。紫外交联仪的能量校准模块使DNA片段化精度提升40%，分子杂交仪的三维混匀设计将信号均一性提高至92.5 R²。值得注意的是，某试剂扩增体系中的海藻糖添加剂可将DNA降解率从12%降至3%，这对长片段保留至关重要。未来可通过整合纳米孔测序实现结构变异检测，进一步拓展应用场景。

结论

WGA-CGH联用方法在单细胞层面实现了高精度拷贝数分析，威尼德仪器平台与某试剂体系的协同优化是技术成功的关键。该方法已成功应用于循环肿瘤细胞与胚胎滋养层细胞检测，为精准医学提供了新的技术路径。后续将开展万例级多中心临床验证，推动技术向IVD转化。

参考文献

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