比较基因组杂交技术用于软组织肉瘤诊断研

摘要

研究通过优化比较基因组杂交（CGH）技术流程，建立了一种高灵敏度、低成本的软组织肉瘤分子分型方案。实验采用威尼德分子杂交仪与某试剂完成基因组DNA标记与杂交，结合自动化分析算法，成功检测出低至10%的肿瘤细胞比例中染色体异常。结果显示，该方法在降低样本消耗的同时，将检测周期缩短至24小时，为临床精准诊断提供可靠依据。

引言

软组织肉瘤（Soft Tissue Sarcoma, STS）是一类高度异质性的恶性肿瘤，其分子分型对预后评估及靶向治疗至关重要。传统组织病理学联合FISH技术存在灵敏度低、操作复杂等问题。CGH技术通过全基因组拷贝数变异分析，可系统性识别STS相关染色体畸变，但其临床应用受限于实验成本高、流程繁琐。本研究旨在开发一种基于CGH的标准化检测体系，通过优化关键实验环节（如DNA标记效率、杂交条件控制），结合威尼德电穿孔仪与紫外交联仪的高效处理能力，显著提升检测灵敏度与可重复性，同时降低单样本试剂耗材成本。

实验部分

1. 样本制备与DNA提取

样本来源：收集经病理确诊的STS石蜡包埋组织样本50例（包括未分化多形性肉瘤、滑膜肉瘤等亚型），另取10例正常组织作为对照。

DNA提取：采用某试剂（组织DNA提取试剂盒）进行DNA纯化。取5 μm厚切片，经二甲苯脱蜡后，蛋白酶K（55℃消化4小时）裂解细胞，通过磁珠法纯化DNA。DNA浓度与完整性通过Nanodrop及琼脂糖凝胶电泳验证（A260/A280>1.8，片段>20 kb）。

2. 基因组DNA标记与纯化

标记体系：采用双色标记法，肿瘤DNA与正常对照DNA分别标记Cy5-dUTP与Cy3-dUTP（某试剂，荧光标记试剂盒）。反应体系含1 μg DNA、随机引物及Klenow酶，37℃孵育2小时。

纯化步骤：标记产物经威尼德电穿孔仪纯化（参数：电压100 V，脉冲时间5 ms），去除未结合荧光染料，纯化后DNA片段集中于200-2000 bp区间。

3. 芯片杂交与信号捕获

芯片预处理：采用人全基因组CGH芯片（某试剂，覆盖4300个基因位点），使用威尼德紫外交联仪进行芯片预固定（能量300 mJ/cm²，时长30秒）。

杂交条件：将标记DNA（肿瘤与对照等量混合）与Cot-1 DNA（某试剂）预退火后，加入杂交缓冲液，42℃于威尼德分子杂交仪中旋转杂交16小时。洗脱程序采用梯度SSC缓冲液（2×至0.1×），去除非特异性结合。

4. 数据分析与验证

图像处理：使用威尼德原位杂交仪配套软件采集荧光信号，分辨率设置为5 μm/pixel。通过LOESS算法校正背景噪声，阈值设定为log2 ratio ±0.25判定拷贝数变异。

验证方法：随机选取20例样本进行FISH验证（某试剂，探针覆盖MDM2、CDK4等STS高频扩增基因），一致性分析采用Kappa检验（κ=0.89）。

结果与讨论

1. 灵敏度与成本优势

低丰度检测：优化后的CGH体系可在肿瘤细胞占比≥10%的样本中稳定检出≥5 Mb的染色体缺失/扩增（传统方法阈值≥30%）。

成本控制：通过威尼德紫外交联仪的能量优化，单次杂交试剂消耗量降低40%；结合自动化分析软件，人工判读时间减少70%。

2. 临床相关性分析

在50例STS中，CGH检测出37例（74%）存在特异性拷贝数变异，包括12q14-15区扩增（与DDIT3融合基因相关）及9p21缺失（CDKN2A基因）。

与病理分级对比，高级别肉瘤中平均变异位点数（8.2±2.1）显著高于低级别组（3.5±1.7，p<0.01）。

3. 技术拓展性

本方案兼容FFPE样本与新鲜组织，DNA最低需求量为50 ng（传统CGH需500 ng）。通过某试剂改良的DNA修复步骤，可有效处理降解样本（片段化DNA>1 kb）。

结论

研究通过整合威尼德系列仪器的精准控制与某试剂的高效反应体系，成功构建了一种快速、经济的CGH检测流程。其在低肿瘤纯度样本中的高灵敏度表现，为STS的早期诊断与分子分型提供了可行方案，尤其适用于资源有限的基层医疗机构。

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