动物来源食品中PFAS非靶向筛查工作流程

串联质谱仪和高分辨率质谱仪都是常用的分析手段，随着受管制化合物数量以及非管制PFAS的监测需求不断增进，HRMS由于能够同时对样品进行定性和定量分析，因此成为理想选择。在数据非依赖型采集实验中，Waters Xevo G3 QTof为全面非靶向筛查（NTS）和发现工作流程提供了所需的灵敏度和分辨率。

• 使用保留时间和质量数亏损结合进行PFAS分析的非靶向筛查（NTS）

• 高性能表面处理后的Premier液相显著提升峰形和灵敏度

• 使用HRMS高灵敏度地鉴定和定量分析鱼类参比样品中低ng/kg浓度的PFAS，满足EURL POPS指南关于方法性能的要求

• 在没有标准品的情况下，分析超出目标和管制范围的PFAS化合物

空白鱼肉匀浆、鱼肉QC样品（T0696QC）和鱼类参比样品（TBK011RM）购自Fapas(英国)。样品储存于-20°C下，4°C下过夜解冻后提取。所有标准品均购自Wellington Laboratories。该方法包含总共30种PFAS，具体如下:

样品前处理按照之前的应用纪要进行¹⁶。在缺少不含PFAS的鱼类的情况下，使用0.025~125 μg/Kg（相当于5 ng/L~25,000 ng/L）范围内的溶剂校正曲线进行样品分析。

使用waters_connect软件平台和UNIFI应用程序进行数据采集和处理。

使用waters_connect平台中的UNIFI应用程序处理MS^E采集模式下生成的数据。完成峰提取和同位素簇步骤后，生成的列表中包含了每次进样检出的所有组分，并列出了保留时间和强度（图1A，数据处理）。使用PFAS谱库筛选这些组分，根据用户要求也可使用其他开源数据库。基于精确质量数和碎片离子进行鉴定，接受母离子质量数测量精度≤3 ppm的推断性鉴定。考虑到目前所列出的PFAS化合物数量超过15,000种，为了提高鉴定可信度并去除假阳性，我们对组分列表应用了多个数据过滤步骤。UNIFI应用程序提供灵活的NTS工作流程，支持不同的用户定义过滤步骤（图1B，数据过滤）。这些用户定义步骤有助于显示与研究相关性最高的组分。

为展示该工作流程中各步骤的作用，在相应的步骤下方展示了引用各步骤后保留的化合物数量。这些数量与鱼类样品TKB011RM相对应，本文以它们为例。

图1. 鱼类参比样品所含PFAS分析的非靶向筛查(NTS)工作流程。

该工作流程可定义为两个步骤：数据处理步骤（图1A）和数据过滤步骤（图1B）。每次过滤后保留的组分数量显示在相应步骤下方。以鱼类样品TKB011RM为例。在研究的所有重复样品中观察到相似的数量级。

UNIFI应用程序中的NTS工作流程是专门为PFAS分析所制定的，完成峰提取步骤和同位素分组后，每次运行都会获得一份所检组分的列表。

在所选的示例TKB011RM中，检出了10,131种组分（图1A），包括与基质相关的组分、背景组分以及PFAS。该工作流程的第一步是比较样品与空白样，在该案例中保留了特有组分或响应提高15倍及以上的组分，去除提取过程中产生的噪音组分，帮助将鱼类样品TKB011RM的候选组分列表从10,131种组分减少到3882种。由于某些类别的PFAS可能会发生源内碎裂，且同系物PFAS系列的洗脱顺序是可以预测的，因此应用了保留时间/质量数过滤器。保留时间/质量数过滤器可定义PFAS同系物可能洗脱的色谱区域，并能够从候选物列表中去除潜在的源内碎裂离子。应用该过滤器后，TKB011RM样品的组分列表大幅减少至259种（图1B）。然后使用质量数亏损过滤器区分PFAS与非PFAS相关化合物。该过滤器将组分列表减少至109种潜在候选物。值得注意的是，质量数亏损过滤器和保留时间过滤器合用效率大增。

表1. 在所研究的鱼类参比样品中鉴定的PFAS汇总。每个样品制备五个重复样。质量精度值表示五个重复样报告的最大质量数误差、标识符碎片离子、测得的质量精度以及相应的鉴定置信水平。ND：未检出。*鉴定水平由Charbonnet等人定义。

通过比较分析物的相对保留时间与校正标准品的相对保留时间，进一步确认PFAS分析物的鉴定结果，所有计算的偏差均小于1%。该结果符合EURL POPs PFAS指导文件中的所有鉴定标准。

根据Charbonnet的PFAS鉴定置信水平标准，PFOA、PFNA、PFHxS和PFOS的鉴定水平为1a的依据是：精确质量数、质量数亏损、与标准品相比的保留时间，以及检测到至少一个碎片离子，其质量精度误差小于等于5 ppm。而PFDA和PFUnDA的注释是基于精确质量数测量结果以及与校准标准品比较的保留时间。PFDA和PFUnDA的峰强度较低，在鱼类参比样品中未检测到特定碎片离子，因此，PFDA和PFUnDA的鉴定水平为3d。

样品中检出的PFOS和PFHxS有直链和支链异构体形式。EURL指南建议比对直链异构体的标准曲线定量分析直链和支链异构体，并单独报告各自的结果，以及检出的所有异构体的总结果（EU指南2022）。图2展示了所研究的鱼类参比样品（TKB011RM和T069QC）中PFOS和PFHxS的提取离子流色谱图（XIC），其中直链和支链异构体均实现了色谱分离。图2展示了分别在TBB011RM和T0696QC中检出的PFOS(图2A和C)与PFHxS(图2B和D)的XIC，其中清楚地区分了直链和支链异构体。

图2. 鱼类参比样品TK8011RM(A，B)和T0696QC(C，D)中的全氟辛烷磺酸(PFOS)（图2A和C）以及全氟己烷磺酸（PFHxS）（图2B和D）的提取离子流色谱图（XIC）。直链和支链异构体实现了色谱分离，使用直链异构体的校正曲线进行了定量分析。

高分辨率质谱分析工作流程可通用于定性和定量分析。对于本例中已鉴定的PFAS(PFHxS、PFNA、PFOA和PFOS)，所有标准曲线的R2值均大于等于0.99，残差小于20%（图3）。PFOS、PFHxS和PFOA在0 μg/Kg~125 μg/Kg范围内呈线性（分别为图3A、B、C）。而PFNA在0.05 μg/Kg~50 μg/Kg范围内呈线性（图3D）。PFHxS和PFOS鉴定出支链形式和直链形式，按照EURL POPs指南的建议，通过比对直链形式的标准曲线对支链形式的浓度进行了定量分析。

图3. 鉴定的四种PFAS的标准曲线。标准曲线通过将低碰撞能量下的离子响应与内标响应之比作图获得。采用1/X加权对线性回归进行拟合，确定系数R2>0.99。A：直链全氟辛烷磺酸（PFOS-L）。B：直链全氟己烷磺酸（PFHxS-L）。C：十五氟辛酸（PFOA）；D：全氟壬酸（PFNA）。

本研究证明了Xevo G3 QTof在筛查、鉴定和定量分析食品基质所含PFAS方面的出色灵敏度。只要有分析标准品，就可以进行定量分析，并且符合EURL POPs指南的规定。

根据EURL POPs《关于食品和饲料中全氟烷基和多氟烷基化合物（PFAS）测定分析参数的指导文件》（Guidance Document on Analytical Parameters for the Determination of Per and Polyfluoroalkyl Substances (PFAS) in Food and Feed），从鱼类参比样品中提取PFAS⁸。使用具有高灵敏度的Xevo G3 QTof结合PFAS精简非靶向筛查（NTS）工作流程，对鱼类参比样品中的PFAS进行了鉴定和定量分析。

UNIFI筛查和定量工作流程可提供丰富的选项，包括从质量数亏损过滤、质量数与保留时间过滤，以及在线数据库和谱库搜索。生成的数据集用于靶向定量方法，也可以通过发现工具集和数据库来源，对新型或之前未报告的PFAS进行回顾性挖掘。

本文所述的每个过滤步骤都是用户定义工作流程的一部分，这些步骤有助于在不更改原始组分列表的情况下实现数据可视化。最新推出的进一步提升数据处理效率的PFAS ANALYSIS软件，更是集成所述的每一步过滤步骤，更结合了基于目前全球不同地区的法规，EPA PFAS Structure List、TSCA 8(a)(7)、POP、SOR、CEPA 等，建立18040全氟化合物数据库。整套流程中集成Premier LC和APGC分离和Xevo G3 QTof表征，基于PFAS ANALYSIS非靶向数据筛查，即使是实验室小白也可以在几分钟之内快速筛查出准确的结果！