如何利用酶切酶连和同源重组技术构建多顺反子表达载体？

 
粘性末端克隆

使用传统酶切酶连法进行克隆时，首先需要分析酶切位点，经分析发现只有AgeI和BstZ17I两个酶切位点可用于EGFRvIII基因克隆，因为另外两个酶切位点BamHI和EcoRI同时存在于EGFRvIII基因的内部，导致无法使用。而P2A元件和iRFP720基因必须和EGFRvIII基因处于同一个读码框，又导致无法使用AgeI酶切位点进行后续的克隆。针对这种酶切位点无法选择的情况，我们可以选择不需要考虑酶切位点的同源重组技术。

使用同源重组技术无需考虑载体的酶切位点，只需在目的片段特异性上、下游引物5’端引入与线性化载体末端同源序列（15-25bp）即可。

1.制备线性化载体：可以用PCR或酶切的方式得到线性化的pLVX-TetOne载体。（最好胶回收纯化）

2.目的基因的引物设计：EGFRvIII上游引物、RFP720下游引物分别与线性化的pLVX-TetOne载体具有15-25bp的同源序列，并且EGFRvIII，P2A及iRFP720片段彼此之间也有15-25bp的同源序列。（这里要提到的是，P2A元件很短，仅有66 bp，有可能被重组酶中的外切酶彻底降解。我们可以通过两轮PCR，在扩增iRFP720基因的上游引物的5’端引入部分P2A序列，即可获得P2A + iRFP重组片段。对于这种目的基因过短的情况，可以采取这种方式。）

3. 目的基因的扩增：EGFRvIII，P2A及iRFP720三个基因的扩增。（最好胶回收纯化）

4. 重组反应：将EGFRvIII，P2A及iRFP720三个基因同时插入到pLVX-TetOne载体中。

5.转化：将重组反应物转化到克隆感受态细胞中。

6.克隆鉴定：通过菌落PCR，双酶切或测序鉴定阳性克隆。

7. 表达：转到表达感受态中进行表达。实现Tet-on诱导表达EGFRvIII基因，同时还能表达iRFP720基因，用于小动物活体荧光成像。