从原料到奶粉，蜡样芽胞杆菌呕吐毒素如何被“揪出来”？

蜡样芽孢杆菌呕吐毒素是一种耐热环状肽类毒素，广泛分布于谷物、乳制品、油脂及营养强化剂等食品中，具有理化性质稳定、耐热性强、不易被常规食品加工工艺降解等特点。婴幼儿配方奶粉是婴幼儿生长发育的主要营养来源，生产过程中通常添加花生四烯酸(ARA)等功能性油脂。此类油脂原料在生产、储存及复配过程中易受环境微生物污染，存在引入蜡样芽孢杆菌呕吐毒素的潜在风险。该毒素可诱发急性恶心、呕吐等食物中毒症状，而婴幼儿机体免疫力较低，对毒素更为敏感，受害风险更高。因此，建立灵敏、准确、稳定的检测方法，对防控婴幼儿配方奶粉安全风险、保障婴幼儿饮食健康具有重要现实意义。

目前，食品中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素的检测以仪器分析法为主。其中，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)兼具灵敏度高、特异性强、抗基质干扰能力好等优势，适用于复杂食品基质中生物毒素的精准定量检测。本研究参照T/WSJD 57-2024《食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定》团体标准，以婴幼儿配方奶粉和花生四烯酸为研究对象，采用乙腈进行样品提取，结合ProElut PLS-A 200mg/6mL(Cat.#: 65932)固相萃取柱净化，选用迪马科技Endeavorsil C18 50x2.1mm，1.8μm (Cat.#：87002)色谱柱分离，建立婴幼儿配方奶粉和花生四烯酸中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素的LC-MS/MS 检测方法。

结果表明: 该方法定量限可达0.1μg/kg，样品加标回收率为90%~100%，方法灵敏度高、准确度好，符合检测技术要求。本方法可应用于婴幼儿配方奶粉的日常风险监测、原辅材料质量把控，同时可为食品安全监管及相关标准制定提供技术支撑，有效保障婴幼儿食品安全。

本方案适用于奶粉、花生四烯酸等食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定，定量限为0.1μg/kg。

(1) 蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准储备液：浓度为100μg/mL(Cat.#: 48955)；

(2) 蜡样芽胞杆菌呕吐毒素工作液 I: 量取定量储备液，用乙腈溶解，配置成浓度为0.1μg/mL工作液；

(3) 蜡样芽胞杆菌呕吐毒素工作液II: 量取定量工作液I，用乙腈溶解，配置成浓度为0.005μg/mL工作液；

(4) ¹³C₆-蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标储备液：浓度为20μg/mL(Cat.#: 48956)；

(5) ¹³C₆-蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标工作液：量取定量内标储备液，用乙腈溶解，配置成浓度为0.1μg/mL内标工作液；

(6) 标准系列工作溶液：准确吸取相应标准工作液和20μL内标工作液，用50%乙腈水定容到1mL，现用现配。

称取1g样品于15mL离心管中，加入内标工作液20μL，静置30min，加5mL乙腈，涡旋混匀30s，超声30min。8000r/min离心5min。转移全部上清液至另一离心管中，加入5mL水，涡旋混匀30s，待净化。

ProElut PLS-A 200mg/6mL(Cat.#: 65932)

(1)活化：用3mL甲醇、3mL水活化；

(2)上样：备用液上样，弃去流出液；

(3)淋洗：用3mL水淋洗，并用洗耳球吹扫固相萃取柱至近干；

(4)洗脱：加入5mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

(5)重新溶解：将洗脱液在40℃水浴下氮吹至0.5mL左右，用乙腈定容至1.0mL，混匀，过0.22μm尼龙膜(Cat.#: 37177)，上机分析。

UPLC条件

色谱柱: Endeavorsil C18，50 x 2.1mm，1.8μm (Cat.#：87002)

流速：0.45mL/min

进样量：5μL

柱温：40℃

流动相：A: 0.1%甲酸2mmol/L乙酸铵水溶液 B: 0.1%甲酸乙腈

梯度设置：

质谱条件

电离模式: ESI

扫描方式: 正离子扫描

检测方式: 多反应监测

电喷雾电压: 5500V

雾化气压力: 50psi

辅助气压力: 50psi

气帘气压力: 20psi

离子源温度: 500℃