上一期，我们为大家解读了Protein L的亲和原理、影响因素，用于双抗副产物杂质去除的机理研究及经典案例。
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MabSelect VL之于双抗纯化的机理浅析
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MabSelect VL用于非对称型三抗纯化
前述WuXi Biologics最新发表的文献中（图1），将MabSelect VL的应用进一步拓展至非对称型三抗分子，样品为某含VHH三抗，具有KiH设计以促进重链异源二聚化，Knob一侧为常规半抗结构，Hole一侧含两个串联的VHH，如图2【1】。
图2：某含VHH三抗分子及四种主要副产物杂质（knob半抗、hole-hole homodimer、knob-knob homodimer、二聚/多聚集）
样品先使用经典的Protein A亲和填料（非Cytiva品牌）进行捕获，只有一个洗脱峰（如图3中A），且SEC-HPLC单体纯度仅92.2%。参考Protein A亲和捕获洗脱组分的SEC-HPLC结果以及非还原SDS-PAGE胶图，产品相关杂质主要有：knob半抗、hole-hole homodimer、knob-knob homodimer以及聚集体，从结构上，目的三抗和杂质分子在轻链可变区VL、轻链恒定区CL以及CH1的数量上存在差异。因此，作者筛选了结合kappa 1/3/4型轻链可变区的Cytiva MabSelect VL填料、结合kappa轻链恒定区的Cytiva KappaSelect填料以及某结合重链CH1亲和填料，并以前述某Protein A亲和填料作为对照。
三种片段亲和填料，对目的三抗及杂质分子具有相似的结合价，如表1。基于前期WuXi Biologics等的研究发现，MabSelect VL和CH1两款片段亲和填料对于不同单抗分子可以体现出不同的亲和力，因此当多抗来源的两侧亲本抗体（相当于homodimer）与填料的亲和力存在明显差异时，更利于非对称型双抗中 homodimer和半抗的去除；而KappaSelect对于不同抗体序列则难以体现出亲和力差异，Protein A（尤其仅结合Fc类型）通常也不具备该特性【5-6】。
参考Ingavat等【7】文献中的方法，将三款填料的结合价以及测试结果进行汇总分析，如表1。
表1：某含VHH三抗与3种不同片段亲和填料的结合价分析以及测试结果
实验结果显示，三款片段亲和填料去除副产物杂质的能力均优于Protein A，且以Cytiva新一代MabSelect VL填料效果最佳（most effective medium），出现多个洗脱峰（如图3中D），有效去除半抗、homodimer，尤其在去除聚集体方面更胜一筹，如图3和表1。
图3：使用4种不同的亲和填料平行纯化某澄清后的含VHH三抗分子。图A为某Protein A亲和填料、图B为某CH1亲和填料、图C为KappaSelect、图D为MabSelect VL。柱体积2-5 mL，KappaSelect的上样量为5 mg/mL填料，其余均为30 mg/mL填料，RT=5 min。经平衡buffer以及高盐、低pH淋洗后，Wash 3为30 mM NaAc-Hac（pH 5.5）。全部拉pH线性梯度洗脱，某Protein A亲和填料及MabSelect VL填料的洗脱终点为30 mM NaAc-Hac（pH 3.2），某CH1亲和填料及KappaSelect的洗脱终点为120 mM Hac（pH 2.9），全部拉20 CV。Inset: 非还原SDS-PAGE胶图片，M：蛋白marker；L：起始样品；FT：穿透；Lanes 1–3/4：分别为洗脱收集组分1–3/4。
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三步变两步：
基于MebSelect VL的两步法双抗纯化工艺
在亲和捕获之后，完整的双抗/三抗纯化工艺还需要精纯步骤进一步去除剩余产品相关杂质及工艺相关杂质，典型工艺为抗体纯化三步法。MabSelect VL在捕获阶段即表现出强大的副产物杂质去除能力，减轻了精纯步骤压力，使得两步法工艺的开发更加易行。
2020年，Chen等就在摸索三种添加剂（NaCl、CaCl2和精氨酸）效应的同时，开发了Protein L和Cytiva Capto adhere两步法纯化Blinatumomab （一种双特异性T细胞连接器BiTE，为scFv串联双抗）的工艺策略【8】。2024年底，WuXi Biologics的Dong等发表文章，基于新上市的MabSelect VL强大特性，分别针对对称型（bsAb A，主要杂质为聚集体）及非对称型双抗（bsAb B，杂质含半抗、homodimer、3/4抗体以及聚集体）开发两步法纯化工艺，结果和基于Protein A的经典三步法工艺质量属性相当，从而节省了工艺时间和成本，且步骤少收率更高【9】。
对称型双抗分子两步法纯化工艺开发
某对称型双抗分子bsAb A，主要杂质为聚集体（含量23.3%，SEC-HPLC）。基于Protein L的片段亲和捕获法，在之前的诸多报道中均被证明可以有效去除双抗聚集体，且加盐添加剂效果更佳【8，10】。类似地，作者在MabSelect VL亲和捕获过程中，通过向step梯度洗脱液中加入少量硫酸铵（筛选4/5/6 mM浓度），进一步提高了聚集体的去除效果，得到的单体纯度范围在89.8–91.9%之间（SEC-HPLC），与Protein A亲和洗脱的单体纯度（79.8%）相比有显著提高，如表2。这可能是由于硫酸铵对于多结合价态的聚集体的结合促进作用比单体更强，放大了二者的亲和力差异。但是，更高浓度的硫酸铵提高纯度的同时也会损失部分收率，最终作者选择了折中的5 mM硫酸铵并最终成功放大到106 mL，单体纯度92%。
表2：针对MabSelect VL Wash 2及elution buffer中硫酸铵浓度进行优化，分别添加4/5/6 mM 硫酸铵，即对应洗脱buffer为20 mM NaOAc?HOAc，4/5/6 mM (NH4)2SO4，pH 3.4。上样量30 mg/mL填料。
剩余8%的聚集体以及其它工艺相关杂质还需要精纯进一步去除。Cytiva复合模式填料Capto adhere（ImpRes）可以通过流穿模式有效去除聚集体，因兼具离子、疏水和氢键作用，比普通阴离子效果更胜一筹，且耐受盐浓度也更高，因此常用于开发双抗精纯工艺【11-15】。
文中WuXi Biologics以高通量的自制96孔板搭配自动化移液工作站筛选不同的load pH（5/6/7/8）及load 电导（0/125/250 mM NaCl）对收率（确保目的样品充分穿透）及纯度的影响。类似的96孔筛选板，可以通过购买Cytiva用于蛋白质纯化的AcroPrep Advance 96孔滤板（推荐低蛋白吸附PES材质Supor滤膜）以及散装填料DIY自制【16-17】，或直接购买预先填充填料的PreDictor 96孔板；可以离心操作、使用真空抽滤装置或搭配自动化移液工作站。
图4：Cytiva AcroPrep Advance 96 孔滤板【16】
结果如表3所示，对于Capto Adhere ImpRes，高pH和高电导的上样条件更利于去除聚集体，但同时收率也随之降低。最终选择折中的50 mM NaOAc-HOAc, 250 mM NaCl（pH 6.0）进行平衡和Wash。使用5.4 mL小柱再次验证，同时测试两种上样量50 mg/mL以及100 mg/mL填料（RT=5 min），SEC-HPLC结果显示单体纯度分别高达99.1% （收率73.8%）和98.6%（收率82.7%），有效去除了聚集体。成功开发两步法工艺。
表3：使用 96孔板筛选Capto adhere ImpRes精纯步骤的上样条件。样品为MabSelect VL洗脱对称型双抗分子A（单体纯度92%），分别筛选loading pH和电导条件。
非对称型双抗分子两步法纯化工艺开发
对于非对称型的双抗分子bsAb B，则具有更复杂的副产物杂质谱，包括典型的半抗、homodimer、3/4抗体以及聚集体。 经过Protein A亲和后，单体纯度仅88.2%（SEC-HPLC）~85%（非还原Caliper毛细管电泳）。而前期研究中，Protein L对于这几类副产物杂质均有分离效果【2】。
图5. 非对称型IgG样双抗及典型产品相关杂质示意图【2】
结果如图6所示，在拉pH 5-3线性梯度洗脱的过程中，结合更弱的半抗、knob-knob homodimer（亲本结合更弱）以及3/4抗体出现在低pH淋洗（W）组分中，hole-hole homodimer（亲本结合更强）以及聚集体则在洗脱峰尾段（收集组分3）出现。并据此优化为step梯度洗脱（pH 3.9），同时在wash buffer（pH 4.8）中加入0.2 M辛酸钠进一步促进HCP去除，成功放大到106 mL。样品纯度提高至95.2%（SEC-HPLC）~ 98.1%（Caliper）。
图6. MabSelect VL用于捕获非对称型双抗bsAb B。柱体积2.9 mL，上样量40 mg/mL填料，RT=5 min。中间低pH淋洗（W）条件：50 mM NaOAc?HOAc，5 mM NaCl，pH 5.0。洗脱buffer A：50 mM NaOAc?HOAc，5 mM NaCl（pH 5.0），洗脱buffer B：50 mM NaOAc?HOAc，25 mM NaCl（pH 3.0）拉20 CV。Inset: 非还原SDS-PAGE胶图，M：蛋白marker；L：起始样品；W：wash；1、2、3为洗脱收集组分，HH和KK分别为hole-hole及knob-knob homodimer标准品。
在精纯步骤选择阳离子交换层析，因其对该样品的HCP去除效果优于阴离子交换。拉NaCl线性梯度洗脱，将单体纯度继续提升至~99%。但作者也提示在缺少阴离子步骤的情况下，需要进一步验证整体工艺的病毒等杂质去除效果是否达到法规要求，并进行优化【18】。
图7. 针对对称型以及非对称型双抗分子，使用MabSelect VL开发两步法工艺及优化策略【9】。针对非对称型双抗也有文献报道使用Capto Adhere 等复合模式填料【8】。
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MabSelect VL工艺优化参考
此外，还可以通过多种策略进一步优化MabSelect VL对复杂抗体的纯化效果：
上下游联动：通过分子改造【19-22】、调整 DNA转染比例【2，23】以及优化培养条件【24】，尽可能放大样品和杂质的差异或使表达向杂质差异最大化的方向推进。同时注意提高分子稳定性，减少产品/工艺相关杂质【25】。
层析工艺参数优化：优化淋洗和洗脱条件，筛选合适的缓冲液类型及浓度【26】、电导（或转换为低pH条件下，仅拉电导梯度洗脱）、pH。优化添加剂方案包括类型及浓度，如NaCl、CaCl2、精氨酸、硫酸铵等（注意添加剂效果和Protein A有差异且对浓度更加敏感）【7，9，27】，同时考虑对HCP等杂质的去除效果【3，8】 。注意不同工艺参数（因子）之间是否存在交互效应。
填料筛选：双抗/三抗等复杂抗体分子产生的片段杂质、以及因错配或不完全组装产生的其它杂质分子，在某些亚结构域（如VH/VL）数量上往往和目标分子有差别，优先选择结合对应区域的亲和填料，而未必是Protein A，依据结合价（Valency）或/及亲和力、分子量等的差异，在捕获阶段即有效地去除副产物杂质，减轻精纯压力，提高整体工艺的稳健性。
除了MabSelect VL之外，Cytiva还提供多款不同结合特性的抗体/片段亲和填料，以覆盖各种分子类型和设计，如图8，包括：
基于Protein A改造而来的：PrismA/PrismA X（PrismA配基，结合Fc区以及增强结合VH3）【28，29】、MabSelect VH3（仅结合VH3，Fc区互作被敲除）【32-33】、MabSelect SuRe（LX）/SuRe 70（SuRe配基，结合Fc区，如用于FcFc*双抗）【28，30，31】，对于低pH敏感样品还可以选择温和洗脱的MabSelect mild elution（仅结合Fc区）。
基于片段亲和的MabSelect VL（结合kappa轻链可变区）、KappaSelect（结合kappa轻链恒定区）【34】和LambdaFabSelect（结合lambda轻链恒定区）。
其中，MabSelect VL以及MabSelect VH3在去除聚集体方面也比经典Protein A略胜一筹，可为优选【1，9，10，32，35】；且因只结合Fab区可能体现出更佳分辨率【1，5，33】；甚至用于homodimer等杂质的监测【4，36】。
图8：Cytiva抗体亲和捕获填料汇总
相对于在早期文献中频繁出现的Capto L，新一代MabSelect VL进行了诸多优化【37】：
耐碱性：MabSelect VL通常耐受0.1 M NaOH CIP清洗，相对于Capto L（耐受15 mM NaOH）有显著提升。针对实际料液，还需要考虑样品的初始结合强度、蛋白酶以及fouling对载量的影响，可以根据料液性质优化CIP策略【37，38】。
载量：针对mab、Fab、dAb测试标准品，MabSelect VL的载量比Capto L有近2倍的提升。对人IgG标准品的载量高达 70 mg/mL（RT=6 min），多抗工艺开发阶段通常上样30-40 mg/mL【1，9，27】。
洗脱pH：可以通过筛选不同的缓冲液体系以及浓度、盐添加剂等来优化并提高MabSelect VL的洗脱pH和分辨率。【10，26，39】。
骨架：相对于Capto骨架，MabSelect骨架更适合抗体大分子，流速压力性能同样卓越。
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结语
综上，面对双抗/三抗等复杂抗体分子的纯化挑战，以MabSelect VL为代表的Protein L亲和填料，以强大的抗体副产物杂质及聚体去除能力，让片段亲和捕获再次站在聚光灯下，使得双抗/三抗等复杂分子的产品相关杂质去除以及两步法工艺更加易行，整体工艺更加稳健，值得推广测试。
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