寡核苷酸酶法合成技术全景解析：传统与创新的协同进化

经典基石

亚磷酰胺法为基础的SPOS技术经过数十年优化，合成流程、质量控制体系高度标准化，适配规模化工业生产，是短链寡核苷酸合成的首选方案。

可高效适配各类修饰核苷（如2'-OMe、2'-F、硫代磷酸酯等），满足核酸药物的多样化修饰需求，是修饰型寡核苷酸合成的核心技术支撑。

短链合成中步骤收率可达99%以上，设备与试剂体系产业化配套完善，规模化生产下成本优势显著。

创新浪潮

核心工艺与特性 

最广泛的技术，通过可逆终止子（RT）封闭dNTP的3′-OH，实现单步碱基精准插入，脱保护后进入下一轮合成，主流RT包括氨基烷氧基、磷酸基、叠氮甲基等，脱保护机制各有不同（如氨基烷基通过亚硝酸盐进行脱保护，磷酸基则用碱性磷酸酶或焦磷酸酶，可实现全酶反应）。

通过一个可切割的linker将dNTP的碱基端共价连接到天然的TdT酶上。共轭结构让酶与底物之间保持恒定的空间邻近，从而促进快速的催化加成反应。酶提供的位阻效应可以确保每轮循环只添加单个核苷酸。这种方式的优势在于不需要对TdT进行大量的工程化改造，缺点在于linker切割时会对oligo链有一定的损伤，需要额外的步骤去恢复。

核心工艺与特性 

以3个Blockmer起始，随后连接成2条部分互补的单链oligo，并留出悬垂端（overhang）；悬垂端作为模板，用于下一轮退火与拼接；交替连接两条寡核苷酸链；通过多轮拼接，最终形成目标双链siRNA。Blockmer通过化学合成，5’端磷酸化由PNK酶（多聚核苷酸激酶）催化，短片段通过悬垂段的互补配对，在RNA连接酶的催化下延长。

针对siRNA、sgRNA等核酸药物，将目标序列拆分为数个短片段，通过杂交形成粘性末端，利用DNA/RNA连接酶催化连接，结合UF/DF（超滤/渗滤）、HPLC纯化，实现高纯度长链合成。

技术协同

提供高纯度合成单体、固相载体、合成柱，优化亚磷酰胺法的耦合效率与修饰兼容性，适配GMP级短链寡核苷酸生产。

提供温度控制精准的反应设备，适配酶法合成的温和反应需求；多样的纯化选择，适配简化的下游处理方案。针对酶法拼接不同步骤的杂质特性（酶、未连接片段、缓冲液添加剂等），提供各类材质和截留分子量超滤膜包、及匹配的硬件设备，实现杂质的高效去除，满足药品质控要求。

（Cytiva酶拼接整体解决方案，C2P）

成熟的siRNA、sgRNA、exRNA等长链寡核苷酸酶法连接合成技术，产物纯度＞96%，适配核酸药物的临床前研发与中试生产。

提供修饰型寡核苷酸的定制化合成，兼容2'-OMe、2'-F、硫代磷酸酯、GalNAc等多种修饰，满足不同核酸药物的研发需求。

开发C2P、C2C酶法合成方案，省去过柱纯化步骤，大幅降低长链寡核苷酸的生产成本，推动核酸药物的规模化应用。

未来展望

未来，随着酶工程技术的进步、可逆终止子的优化、合成工艺的整合，酶法合成将进一步提升修饰兼容性、合成精度、规模化效率，而Cytiva与上海兆维科技也将继续深化合作，从工艺平台、设备优化、技术产业化出发，共同推动寡核苷酸合成技术的升级，为核酸药物、基因编辑、分子诊断等领域的发展提供核心原料支撑，助力生物医药产业的创新突破。

1. Nanfeng Gao, Aimiao Yu, Weikang Yang, et al. Enzymatic de novo oligonucleotide synthesis: Emerging techniques and advancements. Biotechnology Advances 82, 108604 (2025). https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2025.108604.

2. Stephanie Paul, Darren Gray, Jill Caswell et al.  Convergent Biocatalytic Mediated Synthesis of siRNA. ACS Chemical Biology 18, 10 (2023), 2183-2187. https://doi.org/10.1021/acschembio.3c00071.

3. Sabat, N., St?mpfli, A., Hanlon, S. et al. Template-dependent DNA ligation for the synthesis of modified oligonucleotides. Nat Commun 15, 8009 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-52141-8