精准识别，快速出击：P300助力呼吸道病原菌检测与耐药性分析

呼吸道感染已被确定为世界范围内导致死亡的主要原因之一，而广谱抗生素的广泛使用也造成了呼吸道病原菌多重耐药菌的出现。然而由于临床传统病原菌检测方法有限，特别是对抗生素敏感性的检测耗时很长。因此，迫切需要开发耐药菌快速检测方法，以缩短诊断周期，精准指导用药。

本应用中，研究者利用P300共聚焦拉曼光谱仪，对6株常见呼吸道病原菌进行了拉曼分类识别模型的构建及菌种预测，并利用单细胞D₂O-Raman法极大缩短了病原菌耐药性检测周期。

• 配套多种机器学习及深度学习算法，提高模型准确性
• 耐药菌检出周期从传统的2-5天缩短至数小时
• 实现微生物单细胞的自动化拉曼光谱检测与智能数据分析

1. 实验设计

1.1 实验菌株

1）用于分类模型构建的病原菌包括：从呼吸道病原菌中分离的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌。

2）用于预测的病原菌包括：从呼吸道病原菌中另外分离的2株大肠杆菌、2株铜绿假单胞菌、2株金黄色葡萄球菌。

3）用于D₂O-Raman耐药性检测的菌株包括：一株无耐药性的大肠杆菌标准株；上述1）中分离的6种菌中的一株多药耐药铜绿假单胞菌。

1.2 实验流程

2.1 呼吸道病原菌拉曼识别模型构建

对临床采集的6株菌进行拉曼光谱采集，各菌的平均拉曼光谱如图1A所示，采用HOOKE IntP线下分析软件对其进行粗略分类，tSNE聚类将6种菌的拉曼光谱分为了6簇，如图1B所示。其中，拉曼光谱指纹峰波段在两个维度中（tSNE1和tSNE2）的贡献如图1C所示。对6株呼吸道病原菌进行分类模型构建，选择XGBoost算法进行模拟训练，最终预测准确率在93%-100%（图1D），其ROC曲线表明该模型的预测性能较为良好（图1E）。

2.2 临床呼吸道耐药菌菌种预测

从临床呼吸道病原菌中分离了大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌各2株，采用上述建好的病原菌库与训练好的XGBoost模型进行拉曼光谱采集与种类预测，结果显示，大肠杆菌的平均预测准确率在80%，铜绿假单胞菌的平均预测准确率在90%，金黄色葡萄球菌的平均预测准确率在100%。

2.3 单细胞D₂O-Raman检测呼吸道病原菌耐药性

对临床分离的多药耐药铜绿假单胞菌，经过重水孵育和拉曼检测后，在4种抗生素培养基中孵育的铜绿假单胞菌均检出重水峰（图3B），这表示该菌对4种抗生素均具有抗性。该结果与对照试验中纸片扩散法结果一致（图3A）。为了观察该菌株在4种抗生素中的活性程度，对其CD/（CD+CH）的峰面积比值进行了统计（图3C）。

在上述D₂O-Raman验证了呼吸道病原菌的耐药性后，本文后续对重水标记的条件进行了确定，临床分离的呼吸道病原菌在20%的D₂O中孵育2~3 h即可实现耐药菌重水标记，而P300共聚焦拉曼光谱仪搭载的拉曼自动采集功能也能在较短时间内实现光谱采集，从而判断病原菌种类及耐药性。

过去，临床病原菌检测均基于培养或分子生物学技术，检测周期长，影响了临床用药决策效率。而本文使用的 P300共聚焦拉曼光谱仪能够在单细胞水平对病原菌进行检测，配合HOOKE IntP智能数据分析软件提供的多种机器学习及深度学习算法，快速准确地预测呼吸道病原菌种类。此外，结合D₂O-Raman技术，P300还可在短时间内完成对细菌耐药性的检测，在提高临床病原菌诊断效率，帮助临床医生给出用药指导方面极具潜力。

Liu, Z., Xue, Y., Yang, C., Li, B., & Zhang, Y. (2023). Rapid identification and drug resistance screening of respiratory pathogens based on single-cell Raman spectroscopy.Frontiers in microbiology, 14, 1065173. 

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