Sievers Eclipse细菌内毒素检测：克服抑制/增强干扰的操作程序

革兰氏阴性菌（GNB）给全球公共卫生造成了最严重的问题之一，因为这种细菌对抗生素有高度耐药性¹，而且会引发肺炎、血液感染、伤口和手术部位感染、脑膜炎等感染性疾病²。细菌内毒素是GNB细胞膜的关键成分，当浓度足够高时会引发致热反应（即高烧）。美国食品药品监督管理局（FDA）要求制药厂进行细菌内毒素检测（BET，Bacterial Endotoxins Testing），重点测量注射用水（WFI，Water For Injection）、制药原材料、成品药、医疗器械等所有涉及注射用药物的GNB污染程度。细菌内毒素的检测方法主要有以下3种：1、凝胶法（Gel-Clot），2、动态浊度法（KTA，Kinetic Turbidimetric Assay），3、动态显色法（KCA，Kinetic Chromogenic Assay）。

鲎试剂（LAL，Limulus Amebocyte Lysate）提取自鲎的血液，用于细菌内毒素检测。当检测到内毒素时，鲎试剂级联就会有一系列酶促反应，酶促反应会放大内毒素的显现。当内毒素与鲎试剂反应时，内毒素会激活酶级联中的第一个因子 — C因子，然后C因子会激活B因子。B因子会作用于凝固酶原，使其成为凝固酶。最后的检测步骤就是凝固（用凝胶法）、浊度（用动态浊度法）或显色（用动态显色法）。下图1是采用动态显色法时鲎试剂级联反应的示意图。

LPS：Lipopolysaccharide，脂多糖

Sievers^? Eclipse细菌内毒素检测仪（以下称Eclipse）采用动态显色法，用405 nm波长（即动态显色法的典型波长）来测量和分析内毒素的浓度。动态显色法使用带有显色基底的鲎试剂。显色基底是一种连接对硝基苯胺（pNA，一种黄色显色剂）的肽。如果样品中存在内毒素，鲎试剂中的酶促反应就会破坏连接pNA的肽键，从而在样品或溶液中释放黄色。可以用分光光度计来测量颜色变化，量化色变后可以得出内毒素浓度。Eclipse还可以使用Fujifilm Wako浊度试剂，也是用405nm波长来测量内毒素浓度。

众所周知，鲎试剂（LAL）化验易受干扰。样品中可能含有抑制或增强内毒素检测的物质，因此产生假性结果。需要对待测样品进行方法适用性测试和抑制/增强测试，以确定克服上述干扰所需的稀释倍数（或其它有效方法）。

本文概述了如何进行抑制/增强测试，如何运行此测试来证明Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪的适用性，以及提供运行样品的方法适用性。方法信息包括：所用的鲎试剂化验方法、化验灵敏度（λ）、验证的稀释倍数、PPC（阳性产品对照）加标浓度、稀释剂、%CV（变异系数）标准、以及平均PPC回收率。

样品信息包括：样品浓度（单位为mg/mL）、内毒素限值（EL，Endotoxin Limit；单位为 EU/mL）、最大有效稀释倍数（MVD，Maximum Valid Dilution）、最小有效浓度（MVC，Minimum Valid Concentration）、平均样品结果（单位为EU/mL）、以及样品储存/处理条件。

• Sievers Eclipse细菌内毒素检测仪，包括分析仪、微孔板、软件

• 鲎试剂（LAL）

• 细菌内毒素检查用水（LRW，LAL Reagent Water）

• 用于干扰测试的材料（如果需要）：

• 细菌内毒素工作标准品（CSE，Control Standard Endotoxin）或细菌内毒素参考标准品（RSE，Reference Standard Endotoxin）
  

• 不含内毒素的稀释管

• 不含内毒素的移液器吸头

• 可调量程移液器，可进行55 μL和1000 μL分液

• 血清移液器

• 不含内毒素的血清玻璃移液器

• 涡旋混合器

应先进行初步的抑制/增强研究，以确定最佳稀释倍数，并评估可能存在的干扰。

表 1. 常见干扰和缓解方法（摘自USP <1085>）

LPS：Lipopolysaccharide，脂多糖

BET：Bacterial Endotoxins Testing，细菌内毒素检测

加标测试是可选程序，旨在进一步证明Sievers Eclipse适用于BET测试。此外还要求进行加标研究，以确定样品容器适用于测试样品。

对新产品进行细菌内毒素检测时，应执行以下程序：

在对新产品进行内毒素检测之前，应先评估阳性产品对照（PPC）的回收率和变异系数（%CV），以检测样品基质所造成的干扰（包括抑制和增强）。此阶段的目标是确定最佳产品稀释倍数，从而将干扰降至可接受的范围之内。最佳稀释倍数应低于最大有效稀释倍数（MVD）。几乎所有产品都会干扰细菌内毒素检测（BET），因此了解产品基质非常重要。确定最佳稀释倍数之后，就可以进行产品验证。

产品验证包括以最佳稀释倍数测试3个不同批次的产品。这种多批次测试可以确保内毒素检测方法在测试不同批次产品时的一致性和稳定性，符合良好生产规范（GMP）和法规要求。