Intabio ZT-ZenoTOF 7600联用系统：快速比较抗体药物不同工艺的电荷异质性差异

在生物制药领域，抗体药物作为治疗多种疾病的“明星药物”，其质量和安全性一直是研发和生产的重中之重，电荷异质性表征则是抗体药物的关键质量属性之一。 

传统的电荷变异体表征方法需通过多轮制备型液相色谱或毛细管电泳进行馏分收集，再通过分析型色谱或电泳确认馏分纯度，最后再通过多轮LC-MS/MS肽图分析进行异构体确认。整个过程操作复杂且耗时，通常需要数天甚至数周的时间。这些方法在实际应用中存在诸多不便，尤其是在需要快速筛选和优化生产工艺时，成为工艺开发的一个重要的限速步骤。

图1. icIEF-UV/MS 在Intabio ZT系统上的分析流程

图2A和图2B展示了两种不同工艺单抗样品的icIEF-UV图谱与icIEF-MS图谱。通过UV结果可以判断两种工艺样品酸碱异构体的个数及比例差异。两种工艺样品的主峰pI一致，说明两种工艺的主要变异体相同；工艺样品S-2与S-1相比酸性变异体的比例更高，碱性变异体的个数和比例也均比S-1更高。MS结果与UV结果镜像对称，表明icIEF -UV 分离的电荷变异体经过化学迁移和质谱电离后信号仍能保持原有的高分离度。通过MS结果进一步鉴定这些酸、碱变异体的类型，从而更加清晰的指导单抗样品工艺开发。

图2.  两种不同工艺样品icIEF-UV图谱和icIEF-MS图谱。蓝色表示S-1图谱，黄色表示S-2图谱。

图3A和3B是S-1和S-2的热图，图中的配色代表了各变异体的相对丰度，颜色越深代表丰度越高。图3C和图3D是S-1和S-2各变异体解卷积后图谱叠图。

从解卷积图谱比较上看，两种工艺酸性变异体的翻译后修饰类型相同，分子量均与各自主峰相差一个或几个Da，推测存在脱酰胺修饰。对于碱性变异体，S-1的2个碱性变异体：B1峰(离子图中*表示)分子量比主峰G0F/G0F分子量增加25 Da，推测在单抗末端氨基酸残基上增加了碱性基团导致。B2峰与主峰相比，各糖型分子量比主峰的分子量减少58 Da，推测为脯氨酸酰胺化的修饰(ProAm)。S-2样品中检测到3个碱性变异体：B1峰与主峰相比，各糖型增加了约88 Da，推测是信号肽残留1个氨基酸残基导致，后续在LC-MS/MS肽图分析中进一步确认了该变异体（SPR1）的存在；B2峰与主峰相比，各糖型减少58 Da，推测为脯氨酸酰胺化(ProAm)的修饰；B3峰与主峰相比，各糖型增加了约771 Da，推测可能是信号肽片段(SPR2)残留。工艺S-2与S-1比较，都存在脯氨酸酰胺化，不同的是工艺S-2比工艺S-1多检测到两个信号肽残留氨基酸的峰。

图3.  两种工艺样品在Biologics Explorer软件上的热图和不同变异体的解卷积叠图。

通过Intabio ZT-Zeno TOF 7600联用系统提供的icIEF-UV/MS工作流在无需离线收集馏分的情况下，一次进样快速获得蛋白电荷变异体的分离和鉴定结果，从UV和MS两个层面快速直观地比较不同工艺产品的差异，使研发人员能够更快地进行工艺优化和质量控制，通过精确的电荷变异体分析，确保抗体药物产品的质量和安全性，为患者提供更可靠的治疗选择。