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提取原代细胞过滤后如何纯化收集到的细胞 | 上海富衡

来源:上海富衡生物科技有限公司 更新时间:2025-06-23 13:15:21 阅读量:98
导读:提取原代细胞过滤后如何纯化收集到的细胞 | 上海富衡



在使用70 μm 细胞滤网过滤后,细胞悬液中可能仍含有多种细胞类型、细胞团或杂质,需进一步通过物理特性筛选、生物学特性筛选或功能特性筛选等方法纯化目标细胞。





基于物理特性的筛选方法





1、离心筛选法

原理:利用不同细胞的大小、密度或沉降速度差异进行分离。

操作步骤:

  • 低速离心洗涤:过滤后的细胞悬液以200-400 ×g离心 5-10 分钟,弃上清,用培养液重悬,去除细胞碎片和杂质。

  • 差速离心:若目标细胞与杂细胞密度差异显著,可通过不同转速分步离心(如先 200 ×g 离心收集大细胞,再 400 ×g 离心收集小细胞)。

适用场景:初步纯化细胞,去除悬浮杂质,操作简单,适合实验室常规使用。


2、密度梯度离心法

原理:利用细胞密度差异,在梯度介质中离心后形成不同分层。

常用介质:Percoll、Ficoll、OptiPrep 等。

操作步骤:

  • 配制密度梯度液(如 30%、50%、70% Percoll 分层加入离心管)。

  • 将细胞悬液轻轻铺于梯度液上层,以400-800 ×g离心 20-30 分钟(无制动)。

  • 目标细胞会在特定密度层形成条带,用吸管小心收集。

适用场景:分离造血干细胞、免疫细胞等密度差异明显的细胞,纯度较高。





基于生物学特性的筛选方法





1、磁珠分选法(MACS)

原理:利用偶联抗体的磁珠与目标细胞表面抗原结合,通过磁场吸附分离细胞。

操作步骤:

  • 细胞悬液与特异性磁珠抗体孵育(如 CD34 磁珠分选造血干细胞)。

  • 将混合液通过磁场柱,结合磁珠的细胞被滞留,未结合的细胞流出。

  • 移除磁场,洗脱目标细胞。

优点:操作简便,无需特殊设备,适合微量细胞分选,细胞活性高。


2、流式细胞术分选(FACS)

原理:通过荧光标记抗体识别目标细胞,利用流式细胞仪根据荧光信号和物理参数(如大小、粒度)分选细胞。

操作要点:

  • 细胞悬液需制备为单细胞悬液(避免细胞团影响分选)。

  • 用荧光抗体标记目标细胞,通过流式细胞仪设定参数(如荧光强度、前向散射 / 侧向散射)分选。

优点:分选精度高,可同时根据多个参数筛选,适合稀有细胞分离,但设备成本高,操作要求严格。





基于贴壁特性的筛选方法(贴壁细胞适用)




大鼠滑膜成纤维细胞

1、差速贴壁法

原理:不同细胞贴壁速度不同,通过更换培养液分离贴壁细胞与悬浮细胞。

操作步骤:

  • 过滤后的细胞悬液接种于培养瓶,在适宜条件下培养(如 37℃、5% CO?)。

  • 每隔 1-2 小时观察,贴壁快的细胞(如成纤维细胞)先附着,未贴壁的细胞(如上皮细胞)可通过换液收集。

适用场景:分离原代细胞中贴壁速度不同的细胞类型,如从组织中分离上皮细胞与成纤维细胞。


2、选择性贴壁法

原理:利用细胞对基质(如胶原、纤连蛋白)的黏附差异进行筛选。

操作步骤:

  • 培养瓶预先包被特异性基质(如胶原 Ⅳ 促进上皮细胞贴壁)。

  • 接种细胞后,目标细胞优先贴壁,未贴壁的杂细胞被洗去。

优点:操作简单,无需特殊试剂,适合分离对特定基质有亲和力的细胞。





基于功能特性的筛选方法





1、克隆培养法

原理:通过有限稀释或单细胞挑取,使单个细胞增殖形成克隆,实现细胞纯化。

操作步骤:

  • 将细胞悬液稀释至低浓度(如 10-50 cells/mL),接种于 96 孔板,确保每孔 0-1 个细胞。

  • 培养至克隆形成后,挑取单个克隆扩大培养。

适用场景:建立细胞系,筛选具有特定功能(如高分泌能力)的细胞克隆。


2、代谢标记筛选法

原理:利用细胞代谢差异,通过添加代谢抑制剂或标记物筛选目标细胞(如 HAT 培养基筛选杂交瘤细胞)。

示例:HAT培养基中,次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)可筛选出能合成 DNA 的细胞,抑制野生型细胞生长。





总结




滤网过滤后,可根据目标细胞的物理特性(密度、大小)生物学特性(表面抗原、贴壁性)或功能特性选择合适的筛选方法。若需高效纯化,可结合多种方法(如先密度梯度离心,再磁珠分选),最终通过鉴定和活力检测确保细胞质量,为后续实验(如培养、分化、功能研究)奠定基础。







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