上海富衡 | 细胞复苏指南

细胞复苏是将冻存的细胞重新恢复到生长状态的关键操作，对于维持细胞活性、保证实验的连续性和准确性至关重要。以下为详细的细胞复苏指南：

准备工作

1. 耗材准备：提前准备好所需的无菌耗材，包括细胞培养瓶、移液管、离心管、移液器及配套枪头。确保这些耗材经过严格的清洗、灭菌处理，避免引入微生物污染。同时，准备好细胞培养所需的培养皿，用于后续观察细胞状态。

2. 试剂准备：配置合适的培养基，根据细胞类型选择相应的培养基，如 DMEM、RPMI - 1640 等，并添加适量的血清（通常为 10% - 20%）和双抗（青霉素 - 链霉素，浓度一般为 1%），为复苏后的细胞提供适宜的生长环境。此外，准备好无菌的磷酸盐缓冲液（PBS），用于清洗细胞。

3. 仪器设备：确保细胞培养箱温度设置为 37℃，二氧化碳浓度为 5%，以模拟体内细胞生长环境。同时，准备好 37℃恒温水浴锅，用于快速解冻细胞冻存管。另外，离心机需提前调试好，设置合适的离心转速和时间，一般转速为 1000 - 1500 rpm，时间 5 - 10 分钟。

细胞复苏操作步骤

1. 从液氮罐取细胞：穿戴好防护装备，包括防冻手套和护目镜，以防止液氮冻伤。迅速从液氮罐中取出目标细胞冻存管，记录冻存管的信息，如细胞名称、冻存时间等。

2. 快速解冻：将取出的细胞冻存管立即放入 37℃恒温水浴锅中，轻轻晃动，加速解冻过程。注意观察冻存管内液体，当只剩少量冰渣时，即可取出，整个解冻过程应尽量控制在 1 - 2 分钟内，避免因长时间处于高温导致细胞受损。这是因为快速解冻能减少冰晶对细胞的损伤，保持细胞活性。

3. 转移细胞：将解冻后的细胞悬液用移液器转移至含有适量预热培养基的离心管中。预热培养基可减少温度变化对细胞的刺激。轻轻吹打混匀，使细胞均匀分布在培养基中。

4. 离心去除冻存液：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，按照设定的转速和时间进行离心。离心结束后，小心取出离心管，弃去上清液。冻存液中含有二甲基亚砜（DMSO），对细胞有一定毒性，通过离心去除冻存液可减少其对细胞的伤害。

5. 重悬细胞并接种：用适量新鲜培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打，确保细胞充分分散，避免细胞团聚。将重悬后的细胞悬液接种到准备好的细胞培养瓶中，轻轻摇匀，使细胞均匀分布在培养瓶底部。接种密度可根据细胞类型和实验需求进行调整，一般按照细胞正常生长密度的 1/2 - 1/3 接种。

6. 培养细胞：将接种好细胞的培养瓶放入已预热至 37℃、二氧化碳浓度为 5% 的细胞培养箱中培养。培养过程中避免频繁移动培养瓶，为细胞提供稳定的生长环境。

复苏后观察与处理

1. 定期观察细胞状态：复苏后的细胞需密切观察。在培养后的 24 小时内，每隔 4 - 6 小时通过倒置显微镜观察细胞状态，包括细胞的贴壁情况、形态特征等。正常情况下，复苏后的细胞会在数小时至 24 小时内逐渐贴壁，细胞形态应饱满、透亮。若发现细胞贴壁不佳、形态异常（如细胞皱缩、肿胀等）或培养基出现浑浊等情况，需及时分析原因并采取相应措施。

2. 换液处理：一般在细胞复苏后的 24 - 48 小时进行首次换液。轻轻吸去培养瓶中的旧培养基，注意不要吸到贴壁的细胞，然后缓慢加入适量新鲜培养基。换液可去除细胞代谢产生的废物，补充营养物质，促进细胞生长。之后，根据细胞生长情况和培养基颜色变化，定期进行换液，一般每隔 2 - 3 天换液一次。

3. 细胞传代：当细胞汇合度达到 80% - 90% 时，需进行传代。按照常规的细胞传代方法，用胰蛋白酶 - EDTA 消化液消化细胞，然后按照合适的比例接种到新的培养瓶中继续培养，以维持细胞的正常生长和增殖。

细胞复苏过程需要严格遵守操作规程，注重细节，才能最大程度保证细胞的活性和复苏成功率，为后续的细胞实验奠定良好基础。