提取原代细胞过滤后如何纯化收集到的细胞 | 上海富衡

在使用70 μm 细胞滤网过滤后，细胞悬液中可能仍含有多种细胞类型、细胞团或杂质，需进一步通过物理特性筛选、生物学特性筛选或功能特性筛选等方法纯化目标细胞。

基于物理特性的筛选方法

1、离心筛选法

原理：利用不同细胞的大小、密度或沉降速度差异进行分离。

操作步骤：

• 低速离心洗涤：过滤后的细胞悬液以200-400 ×g离心 5-10 分钟，弃上清，用培养液重悬，去除细胞碎片和杂质。

• 差速离心：若目标细胞与杂细胞密度差异显著，可通过不同转速分步离心（如先 200 ×g 离心收集大细胞，再 400 ×g 离心收集小细胞）。

适用场景：初步纯化细胞，去除悬浮杂质，操作简单，适合实验室常规使用。

2、密度梯度离心法

原理：利用细胞密度差异，在梯度介质中离心后形成不同分层。

常用介质：Percoll、Ficoll、OptiPrep 等。

操作步骤：

• 配制密度梯度液（如 30%、50%、70% Percoll 分层加入离心管）。

• 将细胞悬液轻轻铺于梯度液上层，以400-800 ×g离心 20-30 分钟（无制动）。

• 目标细胞会在特定密度层形成条带，用吸管小心收集。

适用场景：分离造血干细胞、免疫细胞等密度差异明显的细胞，纯度较高。

基于生物学特性的筛选方法

1、磁珠分选法（MACS）

原理：利用偶联抗体的磁珠与目标细胞表面抗原结合，通过磁场吸附分离细胞。

操作步骤：

• 细胞悬液与特异性磁珠抗体孵育（如 CD34 磁珠分选造血干细胞）。

• 将混合液通过磁场柱，结合磁珠的细胞被滞留，未结合的细胞流出。

• 移除磁场，洗脱目标细胞。

优点：操作简便，无需特殊设备，适合微量细胞分选，细胞活性高。

2、流式细胞术分选（FACS）

原理：通过荧光标记抗体识别目标细胞，利用流式细胞仪根据荧光信号和物理参数（如大小、粒度）分选细胞。

操作要点：

• 细胞悬液需制备为单细胞悬液（避免细胞团影响分选）。

• 用荧光抗体标记目标细胞，通过流式细胞仪设定参数（如荧光强度、前向散射 / 侧向散射）分选。

优点：分选精度高，可同时根据多个参数筛选，适合稀有细胞分离，但设备成本高，操作要求严格。

基于贴壁特性的筛选方法（贴壁细胞适用）

大鼠滑膜成纤维细胞

1、差速贴壁法

原理：不同细胞贴壁速度不同，通过更换培养液分离贴壁细胞与悬浮细胞。

操作步骤：

• 过滤后的细胞悬液接种于培养瓶，在适宜条件下培养（如 37℃、5% CO₂）。

• 每隔 1-2 小时观察，贴壁快的细胞（如成纤维细胞）先附着，未贴壁的细胞（如上皮细胞）可通过换液收集。

适用场景：分离原代细胞中贴壁速度不同的细胞类型，如从组织中分离上皮细胞与成纤维细胞。

2、选择性贴壁法

原理：利用细胞对基质（如胶原、纤连蛋白）的黏附差异进行筛选。

操作步骤：

• 培养瓶预先包被特异性基质（如胶原 Ⅳ 促进上皮细胞贴壁）。

• 接种细胞后，目标细胞优先贴壁，未贴壁的杂细胞被洗去。

优点：操作简单，无需特殊试剂，适合分离对特定基质有亲和力的细胞。

基于功能特性的筛选方法

1、克隆培养法

原理：通过有限稀释或单细胞挑取，使单个细胞增殖形成克隆，实现细胞纯化。

操作步骤：

• 将细胞悬液稀释至低浓度（如 10-50 cells/mL），接种于 96 孔板，确保每孔 0-1 个细胞。

• 培养至克隆形成后，挑取单个克隆扩大培养。

适用场景：建立细胞系，筛选具有特定功能（如高分泌能力）的细胞克隆。

2、代谢标记筛选法

原理：利用细胞代谢差异，通过添加代谢抑制剂或标记物筛选目标细胞（如 HAT 培养基筛选杂交瘤细胞）。

示例：HAT培养基中，次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）可筛选出能合成 DNA 的细胞，抑制野生型细胞生长。

总结

滤网过滤后，可根据目标细胞的物理特性（密度、大小）、生物学特性（表面抗原、贴壁性）或功能特性选择合适的筛选方法。若需高效纯化，可结合多种方法（如先密度梯度离心，再磁珠分选），最终通过鉴定和活力检测确保细胞质量，为后续实验（如培养、分化、功能研究）奠定基础。