分子相互作用相互仪（MP-SPR）在毒素诱导膜孔形成的检测方

       成孔毒素是一类与细胞膜相互作用导致溶血孔的蛋白家族，对靶细胞具有致命性。在水中，蛋白质被牢固地折叠，但在与细胞膜脂相互作用时，它们成为低聚整体膜结构。毒素的结合取决于膜的结构。

      多参数表面等离子体共振(MP-SPR)是一种高灵敏度、无标记的研究表面变化的方法。脂质囊泡层分布在传  感器表面，测量了四种海葵放线素与脂质的相互作用。与其他两种放线酶相比，溶血素I和II具有明显更高的结合和成孔能力。发现脂质结构中的胆固醇增加了equinatoxin II和fragaceatoxin C的结合。

概述

       生物分子相互作用是药物发现和生物传感器开发领域的常规测量。表面等离子体共振(SPR)是一种成熟的方法，用于测量结合亲和力和动力学。综合多参数表面等离子体共振(MP-SPR)仪器可以在宽角度范围(40-78度)和多个波长进行测量，从而使MP-SPR成为测量脂质，膜提取物和活细胞相互作用的绝佳工具。

       MP-SPR仪器的光学设置可以同时测量多个光学参数。使用PureKinetics™功能，参数的相互关系允许对干扰体信号进行简单的在线表征，并能够实时校正体效应。当使用改变缓冲液或不存在Z佳参考表面时，例如在与脂质层或材料的分子相互作用期间，这是非常有用的。

材料与方法

       用洗涤剂3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨]-1-丙磺酸清洗表面后，脂质囊泡附着在羧甲基葡聚糖包被的传感器载玻片上。模型脂质系统含有1,2 -二甘油酯- sn-甘油- 3 -磷酸胆碱(DOPC)和鞘磷脂(SM)，含和不含胆固醇(Chol)。脂质囊泡作用于葡聚糖表面(0.5 mM脂质浓度)12分钟。用50mm NaOH冲洗未结合的脂质。牛血清白蛋白(BSA)被用作阻断分子，以防止任何非特异性结合底物。运行缓冲液为10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4。

       研究了三种海葵产生的Equinatoxin II (EqtII)、fragaceatoxin C (FraC)、sticholysins I和II (StnI和StnII)(图1)。4.0 μM放线素作用于脂质表面10分钟，计算结合质量(ng/cm²)。利用CHAPS对传感器表面进行再生。

图1。海葵放线素(成孔毒素)与脂质膜结合导致细胞死亡。采用MP-SPR法测定Equinatoxin II (EqtII)、fragaceatoxin C (FraC)、sticholysin II (StnII)和sticholysin I (StnI)与脂质囊泡的结合。

结果和讨论

      所选的放线酶具有非常相似的分子结构。然而，孔隙形成活动是已知的不同。根据MP-SPR测量，StnII和StnI与DOPC:SM(4:1)脂质囊泡的结合比FraC和EqtII放线素的结合高3倍以上(图2a)。当膜中含有胆固醇(DOPC:SM:Chol, 1:1:1)时，FraC和EqtII的结合明显增加(图2b)。MP-SPR结果与等温滴定量热法(ITC)结果吻合良好(图3)。

      放线酶的成孔能力与对脂质结构的亲和力有关。差异是由分子前30个n端残基的序列变化引起的。Garcia-Linares等(2016)进一步研究了sticholysins II色氨酸残基对孔隙形成活性的影响。利用MP-SPR研究了天然和突变型胆溶素ii在不同脂质组成的膜上的结合。

图2。与equinatoxin II, fragaceatoxin C (A)相比，放线素分解酶I和分解酶II在DOPC:SM(4:1)脂质体上的结合明显更强。然而，当脂质成分中含有胆固醇时，EqtII和FraC的结合增加(B)。质量值(ng/cm²)是两次测量的平均值。DOPC = 1,2 -二油基- sn-甘油- 3 -磷酸胆碱，SP =鞘磷脂。

图3。采用等温滴定量热法(ITC)研究了StnII和EqtII与DOPC:SM囊泡的结合。ITC的结果与MP-SPR的结果非常一致。

结论

       MP-SPR为毒素相互作用机制提供了有价值的信息。小分子量或大分子量毒素的相互作用可以实时和无标签测量。除了膜研究之外，分子与靶分子、生物材料和活细胞的相互作用也可以使用MP-SPR方法进行研究。在相互作用测量之前，可以使用MP-SPR提供的厚度和折射率信息来确定脂质的构象。