荧光剂与荧光显微镜配合使用，可观察标本中的特定细胞成分。试剂可以是荧光染料（如 ATTO Rho6G（罗丹明））、荧光蛋白（如 GFP（绿色））或免疫荧光染色剂（如 ATTO 488-抗体共轭物）。荧光蛋白在相关细胞蛋白中表达与遗传相关。它们通常用于研究活细胞。在某些情况下，荧光蛋白会导致有关细胞蛋白的功能障碍或误解。如果蛋白质克隆不可能或不切实际，例如涉及组织学标本，则可使用免疫荧光染色等技术来观察感兴趣的细胞蛋白质。为此，抗体与不同的荧光染料相连，以便直接或间接地与目标结构结合。甚至还有针对特定应用的活细胞染料品种，可以观察细胞器，如内质网（ER）、线粒体和高尔基体。还有一些功能测试可对活细胞进行标记，以跟踪细胞增殖和凋亡等过程，以及区分活细胞和死细胞（活/死检测）。即使是非生物物质，如细胞中的钙（Ca）离子，也可以用荧光钙指示剂来检测。
本文将介绍常用的荧光染料并概述其特性。荧光显微镜借助荧光染料、荧光蛋白或使用抗体的免疫荧光染色来研究特定的细胞成分。由于荧光剂种类繁多，荧光显微镜可用于检查蛋白质、核酸、聚糖、细胞器和其他细胞结构。
荧光染料和显微镜
荧光剂与荧光显微镜配合使用，可观察标本中的特定细胞成分。试剂可以是荧光染料（如 ATTO Rho6G（罗丹明））、荧光蛋白（如 GFP（绿色））或免疫荧光染色剂（如 ATTO 488-抗体共轭物）。荧光蛋白通过基因连接，在相关细胞蛋白中表达[1]。它们通常用于研究活细胞。在某些情况下，荧光蛋白会导致有关细胞蛋白的功能障碍或误解。如果蛋白质克隆不可能或不切实际，例如涉及组织学标本，则可使用免疫荧光染色等技术来观察感兴趣的细胞蛋白质。为此，抗体与不同的荧光染料相连，以便直接或间接地与目标结构结合。甚至还有针对特定应用的活细胞染料品种，可以观察细胞器，如内质网（ER）、线粒体和高尔基体。还有一些功能测试可对活细胞进行标记，以跟踪细胞增殖和凋亡等过程，以及区分活细胞和死细胞（活/死检测）。即使是非生物物质，如细胞中的钙（Ca）离子，也可以用荧光钙指示剂来检测。下文概述了最常用的荧光染料。
利用点击化学进行荧光标记
一般来说，"点击化学 "利用的是无有害副产物、化学收率高和产物稳定的化学反应 [2]。科学家可以利用点击化学来开发化学反应，通过将小单元连接在一起，快速可靠地生成物质。这使他们能够使用非天然氨基酸 (UAA) 对生物大分子与抗体和纳米抗体进行正交荧光标记。ATTO-TEC 和其他公司生产的叠氮和炔烃官能化染料可用于点击化学应用 [3]。点击化学反应的例子包括铜催化的 Huisgen 叠氮烷烃环化反应，在染料和目标分子之间形成三唑连接；以及作为点击试剂的 DBCO 衍生物染料，用于无催化、应变促进的叠氮烷烃环化反应 [3]。
免疫荧光染料
通过荧光标记抗体与细胞中特定的相关蛋白质结合，就可以用荧光显微镜对这些蛋白质进行研究。就组织学标本而言，无法使用荧光蛋白，因为标本一般来自不表达任何荧光蛋白的生物体。此外，如果有有效的抗体，使用免疫荧光技术比荧光蛋白技术要快得多。
免疫荧光利用了抗体与抗原的特异性结合亲和力。它采用了两种不同的方法。直接免疫荧光是最简单的方法，它将荧光标记的抗体直接与感兴趣的蛋白质结合。不过，在大多数情况下使用的是间接免疫荧光。它需要两种抗体，其中第一种（第一抗体）与目标蛋白质结合，但本身不带荧光标记。第二种抗体（第二抗体）与第一抗体结合，专门携带荧光染料。间接免疫荧光有几个优点。一方面会产生放大效应，因为往往不止一种二抗与一抗结合。另一方面，用相关荧光染料标记的二抗通常比一抗更容易找到。
FITC和TRITC
异硫氰酸荧光素(FITC)是一种有机荧光染料，目前仍常用于免疫荧光和流式细胞术中。它的激发峰和发射峰分别为 495 纳米和 517 纳米，可借助其活性异硫氰酸酯基团与蛋白质的氨基、巯基、咪唑酰基、酪氨酰基或羰基结合，从而与不同的抗体偶联。FITC 是最早用于荧光显微镜的染料之一，也是 ATTO 488、Alexa 488 等其他荧光染料的前身。它的荧光活性源于其自身的大共轭芳香电子结构，在蓝色光谱中会被光所激发。用 ATTO 488 染色的标本示例见图 1。
图 1：甲醇固定的 MDA-MB-468 细胞图像，其中 EGF 受体用 AZ-271 标记的 affibody（红色）染色，Ki67 用抗 Ki67 的兔 IgG（一级）染色，ATTO-647N 标记的抗兔的驴 IgG-fab2-片段（二级，蓝色）染色，管蛋白抗体用抗 beta 管蛋白的鼠 IgG（一级）染色，ATTO 488 标记的抗鼠的驴 IgG-fab2-片段（二级，绿色）染色、蓝色）、小鼠 IgG 抗 beta 管蛋白抗体染色（一级）和 ATTO 488 标记的驴 IgG-fab2-片段抗小鼠抗体染色（二级，绿色）。
经常与FITC配合使用的一种染料是同出一门的TRITC（四甲基罗丹明-5-（和6）-异硫氰酸酯）。与 FITC 不同，TRITC 不是荧光素，而是罗丹明家族的衍生物。罗丹明还具有大型共轭芳香电子系统，这使其具有荧光特性。TRITC被最大波长为550纳米的绿色光谱光激发。其最大发射波长为 573 纳米。抗体与蛋白质的结合是以活性异硫氰酸酯基团为基础的。
尽管 FITC 和 TRITC 仍被广泛使用，但由于它们的光稳定性低、水溶性差，属于弱荧光染料，因此不建议用于最新显微镜检查。
其他类型的染料
ATTO 染料或标签包括许多亲水性荧光染料、荧光淬灭剂以及大斯托克斯偏移和氧化还原染料，它们都用于荧光显微镜。有些 ATTO 染料基于基本荧光物质，如香豆素、罗丹明、羰基罗丹明、噁嗪或吖啶。例如 ATTO 386H、ATTO 465、ATTO 532、ATTO 647N 和 ATTO 680。例如，ATTO 488 的激发最大波长为 500 纳米，发射最大波长为 520 纳米。它的特性与 FITC 相似，但稳定性更好，亮度更高，pH 值敏感性更低。用不同 ATTO 染料染色的样本示例见图 2 和图 3。
图 2：相分离的巨-单拉美柱状泡（赤道扫描），液相用 ATTO 488-DPE（绿色）标记，液相用 ATTO 647N-DOPE（红色）标记。
图 3：甲醇固定 MDA-MB-468 细胞，用小鼠 IgG 抗 beta-微管蛋白（一级）和用 ATTO 488 标记的驴 IgG-fab2-片段抗小鼠（二级）微管蛋白抗体染色。
DNA/RNA（核酸）染色
有时，科学家可能需要研究细胞中的核酸，例如，借助荧光显微镜，通过检测细胞核来计数特定类型的细胞或确定它们的确切位置。最常见的DNA染色剂之一是DAPI （4',6-二氨基-2-苯基吲哚），主要与DNA双螺旋富含A-T的区域结合。与未结合态相比，DAPI在DNA上的荧光强度增加。它被紫外线激发，最大波长为 358 纳米。发射光谱宽，峰值为461纳米。弱荧光也可以检测到RNA结合。在这种情况下，发射转移到500纳米。有趣的是，DAPI能够渗透完整的细胞膜。因此，该染料既可用于固定细胞也可用于活细胞。
其他常用的 DNA 染色剂有 Hoechst 染色。Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 都是双苯并咪唑类化合物，具有夹杂 DNA 中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）区域的倾向。与 DAPI 类似，这些染料被紫外光激发，与 DNA 结合时在 455 纳米处有发射最大值（未结合时为 510 至 540 纳米）。Hoechst 染色剂具有细胞渗透性，因此可用于固定细胞和活细胞。此外，它们的毒性也低于 DAPI。
碘化丙啶是一种膜渗透性 DNA 染色剂，通常用于区分细胞培养中的活细胞和死细胞，因为它无法进入完整的细胞。碘化丙啶也是一种插层剂，但对不同的碱没有结合偏好。在与核酸结合的状态下，它的激发最大波长为 538 纳米，发射最高波长为 617 纳米。未结合的碘化丙啶激发和发射最大值向低波长和低强度移动。它也可以在不改变其荧光特性的情况下与RNA结合。要区分 DNA 和 RNA，必须使用适当的核酸酶。
吖啶橙是一种无需任何修饰就能区分 DNA 和 RNA 的染料。与 DNA 结合时，其激发/发射最大对波长为 502 nm/525 nm；与 RNA 结合时，其激发/发射最大对波长为 460 nm/650 nm。此外，该染料还可以进入酸性间室中，如溶酶体。阳离子染料在酸性间室中质子化。在这种酸性环境中，吖啶橙受蓝色光谱中的光激发，而橙色区域的发射最强。该染料通常用于识别凋亡细胞，因为凋亡细胞有很多被吞噬的酸性间室。
间室与细胞器特异性染料
有许多特定的染料可用于研究细胞区室，如溶酶体、内体或液泡（存在于酵母中，如 S. cerevisiae）以及细胞器，如线粒体、内质网 (ER)、高尔基体和细胞核。图 4 和图 5 举例说明。
细胞区室和细胞器可使用 ATTO-TEC 公司的抗体标记试剂盒进行染色 [3]。科学家可以利用多克隆和单克隆 IgG 抗体或其他蛋白质（如 ATTO 488 和 ATTO 643 结合物）对标本进行有效标记。
在研究蛋白质分泌时，通常会对内质网进行染色。DiOC6(3) [3,3′-二己基氧杂羰花青碘化物]是染色该细胞器的一种经典染料，它是一种绿色荧光亲脂性染料，可渗透细胞并偏爱 ER 膜[4]。不过，它仍能与线粒体等其他细胞器的膜结合 [4]。
还可以借助于对细胞中不同位置有偏好的蛋白质来染色感兴趣区域。这种方法的一个例子是小麦胚芽凝集素(WGA)的使用，它与存在于质膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特异结合。
图 4：小鼠小脑皮层三重标记矢状切片中的浦肯野细胞或神经元。图像中，红色表示钙宾蛋白-D28k 钙结合蛋白（抗钙宾蛋白-D28k/Cy3），绿色表示神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）[抗 GFAP/Cy5]，蓝色表示细胞核（Hoechst 33258）。
图 5：用 DAPI（细胞核，蓝色）、抗-α-tubulin-ATO 488（微管，绿色）和抗-TOMM20-ATO 643（线粒体，红色）染色的 U2OS 人 骨肉瘤 细胞。图像采用共聚焦显微镜拍摄。
间室与细胞器特异性染料
许多重要的细胞过程，包括细胞器和囊泡运动、细胞运动、细胞分裂、细胞分裂、细胞信号传导和维持细胞形状，都涉及肌动蛋白。肌动蛋白是一组球状多功能蛋白质，构成细胞骨架中的微丝。可用于所有 ATTO 染料的类胶体素共轭物可为肌动蛋白丝的染色和可视化提供强有力的工具[3]。
磷脂在细胞结构和功能中发挥着重要作用。磷脂具有两亲性，能够形成脂质双分子层，因此是构成生物膜（如血浆膜和细胞内膜）的主要成分。磷脂等标记膜探针是研究细胞的有用工具。
结构、脂质代谢、信号转导、跨膜扩散等。ATTO-TEC 公司提供多种磷脂，这些磷脂以甘油为基础，带有一个或两个脂肪酸（亲油基团）和一个磷酸盐单酯残基（亲水基团），磷酸盐单酯残基可进行荧光标记[3]。例如，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DMPE）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1-palmitoyl-2-hydroxy-snglycero-3-phosphoethanolamine (PPE)、1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE)。
离子成像
就神经元研究、基因活动或细胞运动而言，研究细胞中的离子浓度是很有意义的。钠、钙、氯或镁离子对许多不同的细胞活动有着深刻的影响。通常，借助荧光标记的螯合剂可以捕获离子，当这些螯合剂与适当的离子结合时，就会改变自身的光谱特性。标记螯合剂的例子有钙指示剂 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和钙绿。对于钠的检测，通常使用SBFI（钠结合苯并呋喃间苯二甲酸钠）或钠绿。此外，PBFI（钾结合型苯并呋喃间苯二甲酸酯）还能检测钾离子。
功能实验
“功能实验”是一个统称，指的是评估各种功能的标准化实验，这些功能可以用荧光标志物进行可视化观察。这些标记物可以包括但不限于上述任何标记技术和荧光团。ATTO-TEC 可为许多功能检测提供染色试剂盒，可轻松应用于各种标本。这些试剂盒利用多克隆和单克隆 IgG 抗体或其他带有 ATTO 染料的蛋白质 [3]。功能检测的一个例子就是众所周知并被广泛使用的活体/死体检测。两个荧光团分别用于标记活细胞和死细胞。在同时掌握这两个值的情况下，就可以评估细胞的总体健康状况。将这些信息与其他标记联系起来，甚至可以加深对任何潜在过程的了解。
荧光染料的激发峰和发射峰是什么？
使用荧光染料时，必须注意其激发和发射波长峰、溶解性、量子产率、亮度和光稳定性。根据具体应用，应使用适当的染料。荧光染料及其各自的激发和发射波长峰的完整列表见下表（PDF 文件）。关于荧光的基本原理[5]，如与荧光染料激发光和发射光之间的波长差有关的斯托克斯偏移，读者可参阅参考文献 4。请注意，峰值是每种染料独特的激发光谱和发射光谱的一部分。在一次实验中选择几种染料同时使用时（如用于多路复用和空间生物学应用），研究人员应注意由于串扰或渗漏造成的激发和发射光谱重叠，这可能导致假阴性或假阳性，或以其他方式使数据模糊不清。细胞和组织中的天然荧光蛋白或生物大分子产生的自发荧光也会使荧光成像失真。在进行植物或藻类实验时，尤其需要考虑到这一点。不过，如果使用激发波长长于 550 nm 的染料，可以减少自发荧光造成的干扰。充分了解染料光谱也很重要，这样才能对激发光源（如 LED、弧光灯或激光线）以及发射滤光器和探测器做出最佳选择。ATTO 染料光谱[3]示例见下图 6。有关 ATTO 染料的激发和发射波长峰、溶解度、量子产率、亮度和光稳定性的信息和数据，请参阅参考文献 2。
图 6：ATTO 488（绿色曲线）和 ATTO 553H（黄色曲线）的荧光发射曲线。可以清楚地看到两个发射光谱的重叠。红线表示 488 发射滤波器的波段。
参考文献：
C.Greb, J. DeRose, Introduction to Fluorescent Proteins：光谱和光度特性概述， Leica Microsystems 科学实验室 (2023)。
K.Horisawa, 利用点击化学对生物分子进行特异性和定量标记，Front.Physiol.2014 秒系统生物学档案，第 5 卷第 5 条。20160677. 请勿：10.3389/fphys.2014.00457.
目录，荧光标签和染料，ATTO-TEC (2024/2025) Leica Microsystems。
A.J. Koning、P.Y. Lum、J.M. Williams、R. Wright，DiOC6 染色显示活酵母细胞的细胞器结构和动力学，《细胞运动和细胞骨架》（1993 年），第 25 卷，第 2 期。2, pp：10.1002/cm.970250202.
W.Ockenga, J. DeRose, An Introduction to Fluorescence：光致发光现象背后的基本理论--荧光和磷光，科学实验室（2023 年）徕卡微系统。
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