建立南荻遗传转化系统及在基因工程中应用

一、引言

南荻（Miscanthus lutarioriparius）作为一种重要的多年生高大禾本科植物，在生物质能源、造纸、纺织等领域展现出巨大的应用潜力。其具有生物量大、纤维素含量高、适应性强等优良特性，是理想的可再生能源原料之一。然而，传统的南荻品种改良方法存在周期长、效率低等局限性，难以满足现代生物质产业对南荻优良品种的需求。随着基因工程技术的发展，建立南荻遗传转化系统成为突破这一瓶颈的关键。通过遗传转化，可以将有益基因导入南荻，实现对其性状的精准改良，从而提高南荻的利用价值，促进相关产业的可持续发展。

二、材料与方法

（一）植物材料

采集野生或栽培的健康南荻成熟种子、幼嫩茎段和叶片作为外植体材料。将采集的材料用清水冲洗干净，去除表面的杂质和灰尘，然后在 70% 的乙醇溶液中浸泡 30 - 60 秒，再用含有 0.1% - 0.2% HgCl₂的消毒液浸泡 8 - 12 分钟，最后用无菌水冲洗 3 - 5 次，备用。

（二）培养基的配制

诱导培养基

以 MS 基本培养基为基础，添加 2,4 - D（2 - 4mg/L）、6 - BA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（30g/L）和琼脂（7g/L），pH 调至 5.8 - 6.0。该培养基用于诱导外植体产生愈伤组织。

继代培养基

MS 培养基添加 NAA（0.5 - 1mg/L）、KT（0.2 - 0.5mg/L）、蔗糖（30g/L）和琼脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。用于愈伤组织的继代培养，保持愈伤组织的生长状态和增殖能力。

分化培养基

MS 培养基中加入 6 - BA（1 - 2mg/L）、IAA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（30g/L）和琼脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。促使愈伤组织分化形成芽。

生根培养基

1/2MS 培养基，添加 IBA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（20g/L）和琼脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。用于诱导芽生根，形成完整的植株。

（三）愈伤组织的诱导

种子诱导

将消毒后的南荻种子接种到诱导培养基上，在温度为 25 ± 2℃、光照强度为 1500 - 2000lx、光照时间为 12 - 16 小时 / 天的条件下培养。观察种子萌发和愈伤组织的产生情况，一般在培养 2 - 3 周后开始出现淡黄色、质地疏松的愈伤组织。

茎段和叶片诱导

将消毒后的茎段和叶片切成约 0.5 - 1cm 的小段或小块，接种到诱导培养基上。培养条件同种子诱导，但茎段和叶片诱导愈伤组织的时间可能稍长，约 3 - 4 周，且不同外植体的诱导率有所差异。对诱导出的愈伤组织根据其质地、颜色等特征进行筛选，选择生长旺盛、质地疏松且颜色均匀的愈伤组织用于后续培养。

（四）农杆菌介导的遗传转化

农杆菌菌株及载体构建

选用合适的农杆菌菌株（如 LBA4404），将目的基因构建到含有合适启动子（如 CaMV35S 启动子或南荻自身的强启动子）和筛选标记基因（如潮霉素抗性基因）的双元载体上。通过电击转化或热激转化等方法将构建好的载体导入农杆菌中。

共培养

将处于对数生长期的农杆菌菌液离心收集，用液体 MS 培养基重悬至 OD₆₀₀ = 0.5 - 0.8。将筛选好的南荻愈伤组织浸泡在农杆菌菌液中 10 - 20 分钟，然后取出用无菌滤纸吸干多余菌液，接种到共培养培养基上（MS 培养基添加乙酰丁香酮 100 - 200μM），在黑暗条件下 22 - 25℃共培养 2 - 3 天。

筛选培养

共培养结束后，将愈伤组织用含有头孢噻肟钠（200 - 500mg/L）的无菌水冲洗 3 - 5 次，以去除表面多余的农杆菌。然后将愈伤组织转移到含有筛选剂（如潮霉素，根据预实验确定合适浓度，一般为 20 - 50mg/L）的筛选培养基（继代培养基中添加筛选剂）上进行筛选培养。每 2 - 3 周更换一次培养基，持续筛选 2 - 3 个月，直至获得稳定的抗性愈伤组织。

（五）再生植株的获得与鉴定

分化与生根

将筛选得到的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，在光照条件下培养，促进芽的分化。待芽长至 2 - 3cm 时，将其切下转移到生根培养基上诱导生根，形成完整的再生植株。

分子鉴定

采用 PCR 技术对再生植株进行初步鉴定，以目的基因特异性引物和筛选标记基因引物进行扩增，检测目的基因是否整合到南荻基因组中。对于 PCR 阳性植株，进一步采用 Southern blotting 分析目的基因的拷贝数，以及 Northern blotting 或实时定量 PCR 检测目的基因在转录水平的表达情况，确保目的基因在南荻中稳定表达且发挥预期功能。

三、结果

（一）愈伤组织诱导结果

通过不同外植体和不同培养基的组合实验，发现种子和幼嫩茎段在诱导培养基上的愈伤组织诱导率较高，分别可达 70% - 80% 和 60% - 70%，而叶片的诱导率相对较低，约为 40% - 50%。诱导出的愈伤组织在继代培养基上能够保持良好的生长状态，经过多次继代后仍具有较高的增殖能力。

（二）遗传转化结果

经过农杆菌介导的遗传转化和筛选培养，获得了具有潮霉素抗性的愈伤组织。在分化和生根培养后，成功获得了再生植株。分子鉴定结果表明，部分再生植株中检测到目的基因的整合和表达，证明成功建立了南荻的遗传转化系统。通过优化转化条件，如农杆菌菌液浓度、共培养时间等，可将转化效率提高到一定水平，为后续的基因工程应用提供了足够数量的转化植株。

四、讨论

（一）组织培养条件的优化

在南荻愈伤组织诱导过程中，外植体的类型和生理状态对诱导率有着重要影响。幼嫩的外植体通常具有更高的诱导潜力，这可能是由于其细胞的分化程度较低，具有更强的再生能力。培养基中的激素种类和浓度是另一个关键因素，不同激素组合对于愈伤组织的诱导、增殖和分化有着不同的调控作用。在本研究中，通过多次试验确定的激素浓度和比例有效地促进了南荻愈伤组织的形成和生长。

（二）遗传转化效率的提高

农杆菌介导的遗传转化过程中，多个环节影响转化效率。农杆菌菌株的选择、载体的构建以及共培养条件等都需要精细优化。乙酰丁香酮的添加在共培养过程中能够显著提高转化效率，可能是通过激活农杆菌的 Vir 基因表达，促进 T - DNA 向植物细胞的转移。筛选剂的浓度和筛选时间也需要谨慎确定，过高的浓度可能导致假阳性或抑制愈伤组织的生长，而过低则无法有效筛选出真正的转化体。

（三）在基因工程中的应用前景

建立的南荻遗传转化系统为南荻的基因工程应用开辟了广阔的道路。通过导入抗逆基因，可以提高南荻对干旱、盐碱等恶劣环境的适应能力，扩大其种植范围。导入与纤维素合成或降解相关的基因，有望进一步提高南荻的生物质品质，优化其在生物质能源和造纸工业中的应用。此外，利用基因编辑技术结合本遗传转化系统，可以对南荻的内源基因进行精准编辑，创造具有特殊性状的新种质资源。

五、结论

本研究成功建立了南荻遗传转化系统，包括外植体消毒、愈伤组织诱导、农杆菌介导的遗传转化以及再生植株的获得和鉴定等环节。通过对各环节的优化，提高了转化效率和再生植株的质量。该遗传转化系统在南荻基因工程应用方面具有重要价值，为南荻的品种改良和生物质资源开发提供了有力的技术支撑，将有力推动南荻相关产业的发展和对可再生能源的利用。未来的研究可以进一步完善该系统，拓展其在更多基因功能研究和应用领域的潜力。