原位杂交核心技术要点剖析与多元应用解析

一、引言

二、原位杂交技术原理

（一）核酸探针

1. 基因组 DNA 探针
   通常是从基因组文库中筛选出来的，包含了特定基因的全部或部分序列。其优点是特异性高，但可能存在与非靶序列的交叉杂交。

2. cDNA 探针
   由反转录合成的互补 DNA 构成，反映了基因的编码序列，在检测基因表达方面有较好的应用，尤其是在 mRNA 水平的检测。

3. RNA 探针
   也称为核糖探针，具有较高的杂交效率和特异性。由于其是单链结构，与靶序列的杂交反应更迅速和稳定，但制备相对复杂，需要特殊的体外转录体系。

4. 寡核苷酸探针
   是人工合成的短链核酸，其长度一般在十几到几十个核苷酸。设计灵活，可以针对特定的基因序列进行优化，但特异性可能需要更精细的设计来保证。

（二）标记物

1. 放射性同位素标记
   具有高灵敏度的优点，能检测到低丰度的靶核酸。但存在放射性污染、半衰期限制以及操作复杂等缺点，在现代研究中的应用逐渐减少。

2. 非放射性标记
   标记的探针通过与抗体结合，再利用显色反应或荧光检测进行可视化。生物素标记的探针可与亲和素或链霉亲和素结合实现检测。荧光素标记则可直接通过荧光显微镜观察，具有操作简便、安全性高和多色检测的优势。

三、原位杂交实验步骤

（一）样本制备

1. 组织样本
   组织取材后需要进行固定，常用的固定剂如甲醛等，其作用是保持组织的形态结构，同时防止核酸的降解。固定时间和温度需要根据组织类型和大小进行优化。固定后的组织需要进行脱水、石蜡包埋或冰冻处理。石蜡包埋组织适合长期保存和切片，但在处理过程中可能会对核酸有一定程度的损伤。冰冻组织则能更好地保持核酸的完整性，但保存条件要求较高。

2. 细胞样本
   对于培养的细胞，可以直接在载玻片上进行培养，待细胞达到合适密度后进行固定。或者通过离心收集细胞，涂片后固定。细胞固定的方法与组织类似，但需要注意避免细胞在操作过程中的丢失和损伤。

（二）探针制备与标记

1. 探针合成
   根据需要选择合适类型的探针，如合成寡核苷酸探针可通过化学合成方法，按照设计好的序列进行合成。对于 cDNA 探针和 RNA 探针则需要通过克隆、反转录或体外转录等方法来获得。

2. 标记方法
   如果使用放射性同位素标记，如 ³²P 标记的核苷酸可通过酶促反应（如切口平移法、随机引物法等）掺入到探针中。非放射性标记可通过化学修饰的方法将标记物连接到探针上，例如标记的 dUTP 通过酶促反应掺入到新合成的探针链中。

（三）杂交反应

1. 预处理
   在杂交之前，需要对样本进行预处理，以增加探针的可及性。对于石蜡切片，需要进行脱蜡、水化处理，然后用蛋白酶 K 消化，使靶核酸暴露。对于细胞涂片或冰冻切片，也需要进行适当的通透处理。

2. 杂交条件
   杂交液的组成包括盐离子浓度、缓冲液、甲酰胺等成分，其比例需要根据探针和靶序列的性质进行调整。杂交温度通常在低于探针 - 靶序列解链温度（Tm）20 - 30℃左右。杂交时间根据探针浓度和样本类型而定，一般需要数小时至过夜。

（四）洗片

（五）检测与结果分析

1. 放射性标记探针的检测
   对于放射性标记的探针，可通过放射自显影的方法进行检测。将杂交后的样本与 X - 光胶片紧密接触，经过一定时间的曝光后，显影、定影，观察胶片上的黑色斑点，其位置和强度反映了靶核酸的位置和表达水平。

2. 非放射性标记探针的检测
   标记的探针可通过与抗抗体 - 酶（如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）结合物反应，然后加入相应的显色底物，产生颜色反应进行观察。生物素标记的探针通过与亲和素或链霉亲和素 - 酶结合物反应后显色。荧光素标记的探针可直接在荧光显微镜下观察荧光信号，通过荧光强度和分布来分析靶核酸的情况。同时，利用共聚焦显微镜等先进设备还可以进行三维成像和更精确的定量分析。

四、原位杂交技术的影响因素

（一）探针质量

（二）样本质量

（三）杂交条件

（四）洗片条件

五、原位杂交技术的多元应用

（一）基因表达分析

（二）染色体分析

（三）病原体检测

（四）神经科学研究

六、结论