想要拍出高质量的多色免疫荧光图，这篇干货必须收藏！

造成荧光信号弱的原因很多。比如样本本身的原因：样本是否保存恰当、靶标蛋白丰度如何等都需要考虑；比如操作问题，可能追溯的原因也很多：固定方法是否破坏抗原表位、拍照操作是否正确、抗体使用是否合适等都有可能。另外，值得一提的是，作为放大效应的「执行者」，高亮度的染料是提升信号的关键。

对于一些高丰度靶标比如 β-tubulin 等，可采用直标一抗（直接法）提供明亮且特异性强的信号，操作简单，且更容易实现同宿主一抗的多色分析，非特异性背景低。值得推荐赛默飞Alexa Fluor Plus直标一抗，信噪比Alexa Fluor提升最高至4倍，目前提供常见肿瘤免疫研究等多个直标一抗panel。

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图1. 使用Alexa Fluor Plus直标一抗，通过多重免疫组化分析正常结肠和结肠癌组织（左图）。右图为左图所使用的一抗清单

图2. Alexa Fluor Plus 405（左图，羊抗兔 IgG 二抗，A48254）与 Dy Light 405（右图）分别检测细胞中的 β-III  微管蛋白。Alexa Fluor Plus 405 信号更亮更优。

苍天啊心疼我的样本，信号一开始好好的，但拍着拍着就没了，荧光淬灭太严重。一朝又回到解放前…，如何应对？

出现这样的问题，除了在操作上要尽量注意避光和使用抗淬灭剂的一些建议外，荧光染料的选择也很重要。例如一些荧光蛋白如 GFP、RFP 很容易发生光漂白，从而导致灵敏度大大降低，常见于靶标分子丰度较低、激发光较强或激发持续时间长等情况。

Alexa Fluor 荧光二抗就能很好改善这个问题，它比绝大多数荧光复合物更耐光淬灭，可提高灵敏度，让您可以从样本中获得更多的信号。不仅如此，其对 pH 值变化极不敏感，在 pH 值 2.5~10 变化的环境中仍保持极高稳定性。

图3. Alexa Fluor染料与Cy?3的光漂白能力比较。用Alexa Fluor? 488 Phalloidin和鼠单克隆抗-α-tubulin标记牛肺动脉内皮细胞的细胞骨架，然后使用Alexa Fluor? 546山羊抗-鼠IgG(上图)，或商业的Cy?3山羊抗-鼠IgG(下图)。结果显示Alexa Fluor更加稳定。

导致免疫荧光高背景的原因不胜其数，比如：封闭和洗涤是否正确？抗体浓度太高？自发荧光干扰？

事实上从二抗自身角度出发，也能发掘出很多原因。比如：是否选用了预吸附二抗？特别是在多色荧光分析中，往往需要多个一抗搭配二抗实验，这就要求使用在非一抗种属中制备的预吸附二抗，降低二抗交叉风险，从而减少背景产生。再者，对于 IgG 丰富的样本，选用预吸附二抗也能起到减少背景的作用。

光谱重叠也可能是背景来源之一，特别是对于多色荧光分析，这对荧光基团光谱范围和数量提出了更高的要求。

Invitrogen 提供了的丰富的高度交叉吸附 Alexa fluor 系列荧光二抗，有较小的光谱重叠，同时光谱覆盖了405-800nm，为多色荧光检测提供更多选择。譬如上文提到的Alexa Fluor Plus 能提供更高的信噪比，更适用有挑战性的样本，譬如神经相关的样本（如图4所示）。

图4. 免疫荧光分析 Alexa Fluor 647 （左）与  Alexa Fluor Plus 647 （右，羊抗小鼠  IgG  二抗，货号 A32728，粉色）检测  E18 Sprague Dawley  原代皮层神经元细胞中的  β-III  微管蛋白。Alexa Fluor Plus 647 （右图）可让您观察更多细节。

表3 “买二赠一”活动二抗部分赠品示例