流式细胞术数据标准化实操技巧：不同海域浮游生物聚类分析

海洋是地球生态与气候系统的核心，流式细胞术作为高通量、高灵敏度的核心检测技术，已成为海洋微生物群落、生物地球化学循环与生态健康监测的关键手段。然而，海洋观测长期面临仪器不统一、前处理差异大、分群主观化、元数据缺失等痛点，导致不同航次、机构与海域的数据难以跨尺度比较与整合，严重制约了欧盟乃至全球海洋科学研究的深度与政策支撑能力。在此背景下，2024年欧盟海洋科学计划聚焦流式细胞术数据标准化召开专题研讨会，Lumi Haraguchi等国际专家分享了可落地的实操技巧与规范。旨在通过统一质控校准、数据采集、元数据与分析分群全流程，打通海洋流式数据的“可比较、可复用、可共享”瓶颈。

报告亮点

• 流式细胞仪的激光器、PMT水平、触发通道等配置直接影响检测结果，不同海域需匹配专属的仪器优化方案，本文中波罗的海/英吉利海峡仅调整触发通道，地中海需调整PMT水平；建立了三步式标准化聚类分析流程（微球校准→噪声门控→散射光-荧光特征聚类），可适配不同海域浮游生物检测，具有通用性和可重复性；

• 不同海域浮游生物的散射光和荧光特征存在固有差异，聚类分析需结合海域生态特征，利用荧光波段（PE/PC/Chla）和尺寸信号辅助区分近缘类群；

• 流式细胞术数据的标准化核心是操作流程统一和术语使用规范，严格遵循该要求可实现不同研究数据的公平性对比与共享。

研究背景与核心目标

本次研究围绕不同海域浮游生物的流式细胞术聚类分析展开，核心是实现流式细胞术（Cyto）数据的标准化与公平性分析，解决不同海域、不同仪器配置下浮游生物检测的技术适配与生态特征识别问题，研究核心分为技术优化和生态特征分析两大维度：针对流式细胞仪的硬件配置优化，明确不同参数设置对检测结果的影响（技术维度）；结合目标海域的浮游生物群落特征，匹配对应的检测与聚类方法（生态维度）；研究的核心目标：制定一套适配不同海域、可重复的流式细胞术数据聚类与分析流程，统一术语与操作规范。

流式细胞仪参数设置优化

核心配置/参数设置调整

仪器配置及设置的细微调整会直接影响检测信号强度、脉冲轮廓及细胞门控位置，需重点优化以下核心参数：

• 激光器：激发波段、功率

• 光电倍增管（PMTs）：发射波段、增益水平

• 触发通道：通道选择、强度设置

配置影响验证实验

使用2.0μm聚苯乙烯荧光微球（PSFLG），在同一台仪器上仅调整PMT水平（L、M、H），结果显示：

• 不同PMT level下，信号强度和脉冲轮廓存在显著差异；

• 细胞散点图中最优门控位置随配置变化而偏移；

• 噪声和非目标颗粒的识别难度随配置调整发生变化。

不同海域仪器配置差异

波罗的海、英吉利海峡、地中海的流式细胞仪核心配置存在明显差异，直接影响检测方案设计，具体参数如下：

研究选取波罗的海（2022年9月）、亚南极辐合带SAZ（2022年7月）、亚热带辐合带STZ（2022年7月）为研究区域，通过流式细胞术检测发现不同海域浮游生物群落的前向散射光（FWS）特征存在显著差异，反映出群落结构的固有区别：

3 个站点均采用不同实验流程处理样本，以优化不同群落类群的检测效果。

BAL与MED 站点：光电倍增管（PMTs）参数未作调整，仅修改触发条件。

CHA站点：调整了光电倍增管（PMT）的增益设置。

不同海域聚类分析实操要点

• 波罗的海BAL

• 检测配置：仅调整触发通道，未改变PMT参数；

• 核心聚类群：RedPicoProk（红色皮体原核生物）、OraPicoProk（橙色皮体原核生物）、RedNano（红色纳米体）、OraNano（橙色纳米体）、RedMicro（红色微体）、OraMicro（橙色微体）；

• 关键技巧：利用藻红蛋白（PE）与藻蓝蛋白（PC）的荧光差异区分近缘类群，通过颗粒长度信号辅助尺寸分组

• 英吉利海峡CHA

• 检测配置：调整了光电倍增管（PMT）的增益设置;

• 核心聚类群：OraPicoProk、RedPico 、OraNano、RedNano、RedMicro、OraMicro、HsNano；

• 关键技巧：OraPicoProk 的前向散射光信号小于 RedPico，且前者有橙色荧光、后者有红色荧光，可通过该特征精准区分。

• 地中海

• 检测配置：仅调整触发通道，未改变PMT参数；

• 核心聚类群：OraPicoProk、RedPicoProk、RedPico、RedNano、OraNano、RedMicro、OraMicro、HsNano；

• 关键技巧：RedPico 仅含叶绿素a荧光，无藻红蛋白荧光，易与 RedNano重叠，需保留3μm微球参照区辅助区分；Nano的叶绿素a荧光易与Pico、Micro重叠，不设置叶绿素a荧光门控限值，仅通过叶绿素a与藻红蛋白/藻蓝蛋白的荧光差异界定；利用图像识别确定纳米体的尺寸上限（20μm）；叶绿素 a 触发通道无法准确区分微体和纳米体，侧向散射光（SWS）触发通道效果更优。

• 触发通道设置：FLR6 触发通道适配Pico/Nano

标准化聚类分析流程

基于Thyssen等人2022年提出的基础散点图方法，结合蓝光激光器和红光激光器的检测信号，制定了三步式标准化聚类分析流程，适配所有研究海域，核心是通过散射光和荧光信号的组合特征定义浮游生物聚类群。

• 基础检测散点图设置

蓝光激光器：基于FWS 和SWS，结合叶绿素 a、藻红蛋白、藻蓝蛋白荧光信号，识别 OraMicro（橙色微型浮游植物）、RedMicro（红色微型浮游植物）、OraNano（橙色纳米浮游植物）、RedNano（红色纳米浮游植物）、RedPico（红色超微浮游植物）、OraPico（橙色超微浮游植物）、HsNano（高散射纳米浮游植物）等类群；

红光激光器：基于SWS侧向角散射光，结合叶绿素 a、藻蓝蛋白、SYBR Green 荧光信号，识别 HetHNA（高核酸异养菌）、HetLNA（低核酸异养菌）、RedRedNano（红色纳米浮游植物）、RedRedPico（红色红色超微浮游植物）等类群。

• 三步式聚类分析操作

• 步骤 1：以荧光微球为参照校准颗粒尺寸

使用 1μm、3μm、10μm 标准荧光微球作为尺寸参照，在散点图中标定不同尺寸范围的颗粒区域，为后续浮游生物类群的尺寸界定提供基准。

• 步骤 2：识别并门控噪声与非目标颗粒

在最高灵敏度设置（SMT）下，识别散点图中的噪声区域和非目标颗粒（如非浮游生物颗粒），通过门控功能将其排除，避免干扰目标浮游生物类群的识别，核心排除两类颗粒：粒径小于1μm的非目标颗粒；粒径大于1μm的非浮游生物颗粒。

• 步骤 3：依据统一术语，结合散射光-荧光特征定义聚类群

严格遵循流式细胞术操作专业术语，根据不同散射光（前向/侧向）与荧光（叶绿素 a、藻红蛋白、藻蓝蛋白、SYBR Green）的组合特征，界定不同浮游生物类群，核心规则：

1. 超微体（Pico）、纳米体（Nano）、微体（Micro）：按尺寸结合散射光信号划分，超微体 <2μm、纳米体2-20μm、微体>20μm；

2. 红色/橙色类群：按荧光波段划分，红色荧光对应叶绿素a/藻蓝蛋白，橙色荧光对应藻红蛋白；

3. 异养菌/自养浮游生物：结合SYBR Green和叶绿素a荧光信号区分，异养菌无叶绿素a荧光，自养浮游生物有特征性叶绿素a荧光。

分析过程分享

仅叶绿素a（Chla），粒径小于10μm的自然组分（可合并为一组）

红色微型浮游植物（RedRedMicro）未在词汇中

检测配置：FL16 触发通道适配大颗粒

FLR25 触发通道适配Micro；PMT 增益水平有调整；

关键操作规范与注意事项

仪器低功耗场景设置

若仪器部署在浮标等低功耗场景（电池/太阳能供电），可开启仪器自动关机功能以节省电量；流式细胞仪非测量状态下功耗较低，但低功耗场景下该设置仍能显著减少能耗（硬件支持时可用）。

测量后反冲洗设置

测量完成后建议开启仪器反冲洗功能，防止样品泵管路内滋生生物膜；若检测样品对回冲的杀菌剂高度敏感，可关闭该功能。

数据导出规范

实验完成后按以下格式导出数据，保证数据的可共享性与可分析性：

• 按检测方案（每个.cyz文件）导出Cytoclus5格式数据，一个方案对应一次导出；

• 按聚类群导出统计数据，选择所有类群、所有通道、所有参数，保存为CSV格式。

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