当商品化直标一抗不可行时，Invitrogen? ReadyLabel? 抗体标记试剂盒有助于弥补直标一抗供应的不足。这些试剂盒采用了具有不同光谱特性的 Invitrogen? ReadyLabel ? 和ReadyLabel ? Plus，专为空间成像设计。此外，这些试剂盒还内置了抗体纯化系统，能够直接在 BSA 或其他蛋白质稳定剂中进行抗体标记，从而实现更高效的操作流程。
这两种标记解决方案设计具有光谱兼容性和可互换性，已被证实能够结合使用，以设计一个 9 重标记的Panel来研究脑肿瘤微环境。当与 EVOS S1000 空间成像系统先进的光谱检测功能以及 Indica Labs HALO? 图像分析软件相结合时，该Panel能够对健康和病变结构进行特征分析，从而更深入地理解脑瘤病理状况。
图 1. 使用 ReadyLabel 抗体标记试剂盒对未偶联抗体进行标记的工作流程。
经福尔马林固定、石蜡包埋的健康人类额叶组织样本（来源：73岁，男性），以及一例额叶的人类混合型神经胶质瘤（星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤）脑肿瘤组织样本（来源：43岁，男性）进行了免疫组化分析。为了显现目标蛋白，对脱蜡后的切片使用 BOND? 系统（徕卡）进行了 20 分钟的热诱导表位处理，随后进行 5 分钟冷却和 5 分钟用去离子水冲洗。组织用 0.1% 的 Triton? X-100 在 1X PBS 中透化处理30 分钟，并在室温下用 3% BSA/5% NGS 的 1X PBS 封闭 1 小时。去除封闭液后，组织在 4°C 的湿润环境中用下表所示的直标一抗进行过夜标记孵育。
表1：
组织样本在 1X PBS 中清洗三次，然后用稀释至 1μg/mL 的Thermo Scientific? DAPI 核酸染色剂（在 1X PBS 中）在室温下染色 5 分钟，随后在 1X PBS 中清洗两次。组织用 Invitrogen? ProLong? Glass固定并室温下固化过夜。使用 EVOS S1000 空间成像系统在 20 倍放大倍数下拍摄单色对照和panel图像，并将其拼接在一起。在创建使用单色对照样本的协议后，在 S1000 软件中进行光谱解析。使用 Indica Labs HALO? 软件（版本 4.0.5107.207）对多重拼接图像进行分析。在额叶组织切片中识别到 12058 个细胞（255 个细胞/mm2），在神经胶质瘤组织切片中识别出 88124 个细胞（749 个细胞/mm2），使用 Indica Labs Halo? 高通量 FL 模块（版本 4.2.14）和 HALO AI Nuclei Seg V2-FL 分析完成。
结果：用于对人类大脑组织样本的额叶进行染色的9-plex panel（包括 DAPI）旨在识别细胞类型和形态。整个抗体标记和染色流程对于 22 个组织样本而言大约需要三个小时，这使得这种方法非常适合进行多重免疫组化检测。标记物的选择是基于它们与关键细胞群体和肿瘤相关变化的相关性。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白被包括在内，用于识别星形胶质细胞的密度和形态，这些在星形细胞瘤中会发生改变。同样，少突胶质细胞转录因子 2（Olig2）被选中用于识别少突胶质细胞的细胞密度。增殖细胞核抗原（PCNA）被包括在内，因为肿瘤组织中可能会出现细胞增殖现象。突触素被选择用于评估突触，而在星形细胞瘤或少突胶质细胞瘤中，突触可能看起来正常，而微管相关蛋白 2（MAP2）主要标记神经细胞，但在少突胶质细胞和星形细胞群体中有时也可能观察到。CD68 被用于识别肿瘤相关的小胶质细胞以及免疫微环境，而 p53 则用于评估肿瘤抑制作用，因为其缺失或突变在脑瘤中较为常见。这一组合使得能够对关键分子特征进行空间原位分析，揭示出能区分健康脑组织与脑瘤的明显表达模式。
图 2. 使用 EVOS S1000 获取的单色对照样本的光谱解析图像的可视化展示（每列代表每个主通道中的单色样本）；每一行对应一个主通道。此信息包含在仪器生成的质量指标报告中，该报告是创建光谱解析矩阵的一部分。
与健康组织样本相比，该组织样本中的细胞形态和分布存在差异。肿瘤组织的细胞密度每平方毫米增加了 294%。波形蛋白与胶质纤维酸性蛋白的共定位显著增加（约 53%），而在健康组织样本中这一比例低于 1%。在肿瘤组织中，胶质纤维酸性蛋白呈现为一个密集的团块，并且其形态发生了改变，每平方毫米的阳性细胞数量增加了 700%。由突触素标记的突触数量似乎相对未变；然而，其形态似乎受到了破坏。微管相关蛋白 2 的形态发生了改变，肿瘤组织中细胞的比例减少了 42%。与健康组织样本相比，肿瘤组织中 p53 阳性细胞的比例降低了 4.6 倍。肿瘤组织样本中微胶质细胞的表达水平也有所上调，表现为 CD68 阳性细胞数量增加了 16 倍。最后，与健康组织相比，胶质瘤（与正常组织相比）组织中 Olig2 的含量也有所增加，但只是定性上有所体现。
图 3. （a）健康人类额叶组织样本染色。组织在 EVOS S1000 空间成像系统上以 20 倍放大进行成像和光谱解析处理。图像亮度和对比度进行了调整，颜色通道被合并，并且使用 HALO 图像分析软件实现了自动化进行细胞分析。（b）从图（a）所示的完整组织样本扫描中收集的感兴趣区域（ROI）展示了健康组织中的细胞形态和分布。健康的组织染色模式在图（c）至（j）的插图中得到了进一步展示：（c）DAPI 核染色（红色），（d）维人波形蛋白，标记内皮细胞和一些星形胶质细胞（绿色），（e）星形胶质细胞标志物 GFAP（蓝色），（f）突触标志物突触素（紫色），（g）PCNA（橙色），（h）神经元标志物 MAP2（青色），（i）Olig2（紫色），（j）肿瘤抑制蛋白 p53（黄色），（k）小胶质细胞标志物 CD68（白色）。
图 4. （a）取自一名 41 岁男性右侧额叶的肿瘤组织样本，该样本经过一组特异性抗体的染色处理。组织样本在 EVOS S1000 空间成像系统上以 20 倍放大进行成像和光谱解析处理。图像亮度和对比度进行了调整，并使用 HALO 图像分析软件进行分析。 （b）从图 4（a）所示的完整组织扫描中提取的感兴趣区域显示了与健康组织样本相比细胞形态和分布的差异。图 3 中的图例：（c）DAPI（红色），（d）人波形蛋白（绿色），（e）胶质纤维酸性蛋白（蓝色），（f）突触素（黄色），（g）PCNA（橙色），（h）MAP2（青色），（i）Olig2（紫色），（j）p53（紫色），（k）CD68（白色）。
图 5.（a）展示了 HALO 软件细胞分割与检测分析的可视化结果，图中显示了脑肿瘤组织样本中的一个感兴趣区域。细胞类型通过不同颜色来表示，其中颜色与图 3 和图 4 中的图像相匹配；对多种标志物呈阳性的细胞以混合颜色显示。 （b）在图 a 所示的细胞分析中所展示的原始未进行光谱解析的荧光感兴趣区域，即脑肿瘤组织样本的图像。
图 6. 通过 HALO 分析软件验证的每种标志物呈阳性的细胞比例情况。
结论
对健康组织与肿瘤组织样本中相似脑区的细胞进行分析后发现，星形胶质细胞和少突胶质细胞的分布和形态以及总体细胞密度存在显著差异。神经元细胞的差异相对较小。肿瘤组织样本的总体细胞密度是健康组织样本的三倍。星形胶质细胞和小胶质细胞的表达显著上调，而肿瘤抑制蛋白 p53 的表达则显著下调。虽然未对少突胶质细胞进行细胞计数分析，但目测证实了肿瘤组织样本中的表达上调情况。这些结果与文献中的预期一致。
由于免疫组化验证的原直标一抗可用，并且针对特定靶点的 ReadyLabel 抗体标记操作简便，因此在不到 24 小时内，通过 EVOS S1000 空间成像系统对两种组织类型进行这个 9 重标记的免疫组化染色，且所需实验操作时间短，包括抗体结合。创建光谱解析协议以及图像采集、拼接和光谱解析操作是非常高效的。该仪器和软件操作简便、用户界面友好。最后，通过Indica Labs 的 HALO 图像分析软件对 9 重标记进行调整和合并，并能轻松生成图表，包括图 3 和图 4 中所示的拼接单通道图像。该软件的AI分割功能能够在短短几个小时内对整个组织样本（数万个细胞）进行计数和分析，包括学习该软件所需的时间。这些工具的组合与传统的免疫组化、成像和分析相比，提供了整体更高效的工作流程。
该研究强调了抗体偶联的高效性和有效性，并极大简化了标记和染色的工作流程。这种效率不会影响结果的质量；相反，它有助于对复杂组织结构进行空间原位分析。在神经胶质瘤样本中观察到的明显表达模式突显了这种方法在区分健康和疾病状态方面的实用性。本研究中所使用的工具组合，有助于我们更清晰地观察和描述脑肿瘤内部复杂的细胞及分子相互作用，这将极大地促进科研人员对肿瘤研究更深入地进行探索。
订购信息
全部评论(0条)
相关产品推荐（★较多用户关注☆）
PCR/基因扩增仪QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR Syste
报价：面议 已咨询 601次
美国赛默飞 基因测序仪3730系列
报价：面议 已咨询 974次
美国赛默飞 QuantStudio 3 D芯片数字PCR系统
报价：面议 已咨询 892次
美国Invitrogen iBright 智能成像系统 CL1000
报价：面议 已咨询 708次
Invitrogen®E-Gel Imager凝胶成像仪
报价：面议 已咨询 613次
美国赛默飞 Applied Biosystems ProFlex™ PCR仪
报价：面议 已咨询 677次
美国Invitrogen Attune NxT流式细胞仪
报价：面议 已咨询 885次
美国赛默飞 SimpliAmp PCR仪
报价：面议 已咨询 998次
你可能还想看
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布，观点仅代表作者本人，不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们立即通知作者，并马上删除。
②凡本网注明"来源：仪器网"的所有作品，版权均属于仪器网，转载时须经本网同意，并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品来源，并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱：hezou_yiqi
热点文章
农残快速检测仪怎么选？养殖加工企业推荐选用指南
近期话题
相关产品
在线留言
沪公网安备 31011502008050号
参与评论
登录后参与评论