新品│CRISPR-Cas12b，赋能超灵敏、快速便携式分子诊断

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌中进化出来用于抵御噬菌体及外源DNA入侵的适应性免疫系统，该技术自发现以来在基因编辑领域大显身手，已成功运用于微生物、哺乳动物、植物的基因编辑中。随着近年来诊疗体系从传统的以医院为中心变为去中心化，检测场景从医院检测变成社区或家用检测，因此开发规模化、自动化、快速化的检测技术成为趋势。科学界发现CRISPR/Cas系统除在基因编辑领域的应用以外，该技术在POCT检测工具开发方面同样具有独特的优势，将现有技术结合CRISPR/Cas系统，有望开发速度更快、灵敏度更高、成本更低、检测特异性更好、操作更便利的POCT检测工具。

图1 CRISPR/Cas系统在分子诊断领域应用示例^[1]

(点击可查看大图)

CRISPR/Cas系统根据Cas蛋白的组成不同和效应复合物的性质，可分类Class 1和Class 2两大类。其中Class 1系统的效应复合物由4-7个Cas蛋白亚基组成，该类别的共同特征是利用多个Cas蛋白效应复合物执行切割功能；Class2系统的效应复合物则是由单个多结构域蛋白行使功能，如Cas9、Cas12、Cas13等。

AapCas12b Nuclease是来源于嗜酸耐热菌(Alicyclobacillus acidophilus)的一种依赖tracrRNA：crRNA(或sgRNA)介导的DNA核酸内切酶，在sgRNA的引导下特异性识别靶标单链DNA (ssDNA)或带PAM (TTN)序列靶标双链DNA (dsDNA)，并对靶序列进行特异性切割，使dsDNA断裂并生成粘性末端。当AapCas12b Nuclease、sgRNA和靶标DNA结合形成三元复合物后，同时激活其对体系中非特异ssDNA的反式剪切活性，可将体系中的任意ssDNA序列切碎。

图2.Cas12b作用原理^[2]

翌圣AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)由ZymeEditor™酶改造平台重组表达而来。AapCas12b Nuclease在37°C～65°C温度范围内具有切割活性，可搭配多种恒温扩增体系进行检测方法开发，具有广阔的应用前景。

产品特点

反应温度范围广：在37°C～65°C温度范围内具有切割活性；

核酸酶残留低：无核酸外切酶、切口酶、RNase A残留；

顺式切割活性：在crRNA和tracrRNA（根据靶标序列进行设计）介导下可识别并特异性切割靶标ssDNA或带PAM序列的靶标dsDNA，切割效果媲美进口品牌T*；

反式切割活性：AapCas12b Nuclease、sgRNA和靶标DNA结合形成三元复合物后，激发其反式切割活性，可将体系中的任意ssDNA序列切碎。

部分性能数据展示

顺式切割活性：效果媲美进口品牌T*

在20 μL的反应体系，含有带PAM序列的双链Target DNA、sgRNA、Cas12b和1×reaction buffer，在60°C下反应30 min，85°C下灭活5 min，在琼脂糖凝胶电泳测定结果显示，三批次AapCas12b Nuclease (10 μM) 均能有效切割双链Target DNA，切割效果与进口品牌T*一致。

图3.AapCas12b Nuclease (10 μM)顺式切割活性验证

反式切割活性：能有效切割体系中的ssDNA

在20 μL的反应体系，含有带PAM序列的双链Target DNA、sgRNA、Cas12b、Report ssDNA荧光探针和1×reaction buffer，在60℃反应1h，每30 sec采集一次荧光信号，结果显示在Target DNA、sgRNA、Cas12b共同存在的情况下，Report ssDNA荧光探针能被切割，从而释放荧光信号。

图4.AapCas12b Nuclease (10 μM)反式切割活性验证

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参考文献:
[1]孙雯君,黄行许,王鑫杰.基于CRISPR的快速灵敏便捷分子检测[J].生物工程学报, 2023, 39(1):14.
[2] Li L, Li S, Wang J. CRISPR-Cas12b-assisted nucleic acid detection platform[J].Cold Spring Harbor Laboratory, 2018(10).DOI:10.1101/362889.

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