SEC-MALS高灵敏度分析PEG化抗体片段

仪   器：VanquishTM UHPLC系统、示差折光(RI)、LenS3 MALS检测器

色谱柱：TSKgel UP-SW2000 (4.6 mmI.D.×30 cm, 2μm)

流动相：100 mmol/L磷酸钠(pH 6.2)+300 mmol/L精氨酸+10%异丙醇

流   速：0.175 mL/min

温   度：25℃

进样量：10 μL

检测器：UV@280 nm；RI和MALS

样   品：20 kDa PEG-Fab、10 kDa PEG-scFv

分析PEG化抗体片段scFv

图2是10 kDa PEG-scFv的UV和RI检测器信号重叠图。框选部分是未反应PEG的信号，PEG无UV响应，但RI相应信号强。

图2. 10 kDa PEG-scFv的RI和UV检测器信号重叠图

通过比较不同峰的RI和UV信号，我们可以确定各个峰的准确组成（两个成分的重量分数），进而确定其对应的折光指数增量值（dn/dc）。

图3是使用SECview对10 kDa PEG-scFv进行成分分析时的结果。各个峰的PEG和scFv重量分数及其对应的dn/dc值见表1。

图3. 10kDa PEG-scFv样品的成分分析  常规校准(CC)

表1.  图3种各个峰的重量分数及对应的dn/dc值

根据获得的dn/dc分布我们计算了10 kDa PEG-scFv样品中多个组分的相对分子量（图4所示）。RI信号显示色谱图（～11.8 min）高分子量区域形成一个双峰，表示PEG化偶联物。峰4和峰3的分子量分别为27 kDa和9.7 kDa，符合未反应的游离scFv和PEG的预期分子量。峰1的分子量为45.1 kDa，对应di-10-PEG-scFv，峰2的分子量为34.4 kDa，对应mono-10-PEG-scFv。

图4. 10 kDa PEG-scFv样品的分子量图

分析PEG化抗体片段Fab

图5. 20 kDa PEG-Fab的RI和UV检测器信号重叠图

图6.  20 kDa PEG-Fab样品的分子量图

SEC-MALS法可用于抗体片段非定向PEG化生成的复杂混合物的表征。将UHPLC色谱柱TSKgel UP-SW2000与LenS3 MALS、UV和RI检测器联用分离样品组分，建立了一种多用途表征方法。该方法可以通过测定单个峰的分子量来确定偶联度。

SECview软件可以简化偶联分析至数分钟内完成。其分析结果有助于优化PEG化反应，从而获得高效、高稳定性的新型生物治疗药物，以及测定成品中的残留杂质。

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