植物海藻糖-6-磷酸(T6P)试剂盒使用说明书

　　植物海藻糖-6-磷酸(T6P)试剂盒使用说明书(仅供参考，请以实际收到说明书为准)

　　检测原理

　　试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被海藻糖6磷酸(T6P)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的海藻糖6磷酸(T6P)呈正相关。用酶标仪在450nm  波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品活性。

　　样品收集、处理及保存方法

　　1. 样本不能含叠氮钠(NaN3)，因为叠氮钠(NaN3)是辣根过氧化物酶(HRP)的yizhi剂。

　　2. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。

　　3. 植物萃取液或其它相关样本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测。

　　4. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

　　自备物品

　　酶标仪(450nm)

　　高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

　　37℃恒温箱

　　操作注意事项

　　试剂盒保存在2-8℃，使用室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶溶解后再使用。

　　实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封(低温干燥)保存。

　　浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍，终结果乘以5才是样本实际浓度。

　　严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

　　所有液体组分使用充分摇匀。

　　试剂盒组成

　　名称96孔配置48孔配置备注

　　微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无

　　标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无

　　样本稀释液6mL3mL无

　　检测抗体-HRP10mL5mL无

　　20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释

　　底物A6mL3mL无

　　底物B6mL3mL无

　　终止液6mL3mL无

　　封板膜2张2张无

　　说明书1份1份无

　　自封袋1个1个无

　　注：标准品(S0-S5)浓度依次为：0、30、60、120、240、480ng/ml

　　试剂的准备

　　20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

　　洗板方法

　　手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

　　自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

　　操作步骤

　　从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

　　设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

　　样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL;空白孔不加。

　　除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

　　弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

　　每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

　　每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

　　结果判断

　　绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

　　试剂盒性能

　　准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

　　灵敏度：检测浓度小于1.0 U/L。

　　特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

　　重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

　　贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

　　有效期：6个月

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