干货 | 反转录全攻略：从RNA到cDNA的关键影响因素！

RT通常会出现两个不同的表述，反转录和逆转录，二者的本质区别在于：反转录是在研究过程中人为提取RNA并以之为模板人工合成DNA的过程。逆转录是RNA病毒自主行为，以RNA为模板形成DNA的过程。前者发生在体外，后者发生在体内。反转录反应的示意图如下图所示：

反转录实验过程

看似简单的反转录实验，但也受到多种因素的影响，如RNA模板质量、引物的选择、反转录酶以及反应条件等等。

RNA由于自身序列折叠，具有不同复杂的二级结构：配对的双链RNA呈螺旋，发卡环，突环，内环，多分支环等结构。由于配对碱基不同，其配对的稳性也不同，如G与C之间的配对，三对氢键，最为稳定。A与U为两对氢键相互作用；G与U为一对氢键相互作用，最不稳定。故对于RNA模板来讲，GC含量越高，二级结构越为复杂。

在进行反转录的过程中，如下图所示，当引物延伸到有二级结构的地方，反应就会被迫终止，影响cDNA的合成长度。此时可建议先将模板进行65℃孵育5min然后迅速冰上冷却使二级结构变性；同时可通过在较高的温度下（如55℃）反应以降低RNA二级结构的形成。

反转录实验延伸过程

RNA纯度会很大程度地影响反转录实验，如RNA纯化过程中混入的盐、金属离子、乙醇、苯酚等均是常见的反转录酶抑制剂。此外植物组织中的多糖多酚和腐殖酸等也会对反转录酶造成抑制作用。

对于RNA纯度的测定，通常会选用紫外分光光度计进行测定。

同时对于RNA浓度的测定，通常也会选用紫外分光光度计进行测定。

RNA的完整度在很大程度上影响着cDNA合成的长度与质量。在进行RNA提取处理储存和实验过程中需要采取特殊的保护措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用无RNA酶污染的实验耗材等。

对于下游的克隆实验，RNA完整度将会影响cDNA的合成长度，从而影响目的基因的合成。对于下游的目的基因定量实验，将会严重影响其CT值，从而影响定量结果精准度（见下图）。

RNA RIN值和CT值的关系

RNA的完整度通常会通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，对于28S和18S rRNA的比值来评估RNA的完整度，接近2:1为较为完整的RNA。

目前，Agilent 2100生物分析仪已逐渐成为RNA样品质量控制（QC）的行业标准，在分析RNA完整性之后给出准确的数值（RIN值），该值在8-10之间表示RNA质量非常好，小于7时表示RNA完整度较差。

在进行下游qPCR实验过程中Totol RNA中混入的gDNA可直接作为PCR反应的模板进行扩增，造成实验结果的假阳性。因此在反转录之前必须要对RNA模板进行去gDNA处理，保证模板中仅有cDNA。

那么如何解决呢？

我们可通过加入DNaseⅠ去除gDNA。但是在反转录实验前需将DNaseⅠ灭活（通过高温加热或加入EDTA），否则该酶会将cDNA降解，但是高温灭活DNaseⅠ会造成RNA的降解和损失，加入EDTA灭活又会引入新的RNA酶抑制剂。

翌圣生物提供的反转录试剂盒含gDNA 消化组分，在反转录之前可将其与RNA模板混匀反应一段时间即可去除gDNA组分，同时此试剂盒中的反转录预混液及工后续的高温灭活环节可终止gDNA消化组分的作用，保证cDNA的完整性。

为了使得反转录能正常启动，反转录酶需要短的DNA核苷酸与其互补序列在RNA模板上结合，作为合成的起点。根据RNA模板类型和下游应用类型，分为三种引物：Oligo(dT)、随机引物和基因特异性引物。

Oligo(dT)引物是约12-18个多聚胸腺嘧啶T组成的重复寡核苷酸序列，能够特异性地与真核生物mRNA的ploy(A)尾退火，故不适合缺少ploy(A)尾结构的RNA，如原核生物RNA或microRNA，也不适用于已降解的RNA，如FFPE样品中RNA。

真核生物中mRNA仅占总RNA的1%-5%左右，通常在进行从真核生物中构建cDNA文库，或者克隆全长cDNA以及3’RACE等研究时会优先选择 Oligo(dT)引物。

对于复杂模板RNA，如含较多二级结构，在进行cDNA的合成延伸过程中，当延伸到二级结构处时，可能会造成延伸终止，若选择Oligo(dT)可能会造成mRNA 5’端信息的丢失。

随机引物是由随机碱基组成的寡核苷酸，通常由6个核苷酸组成，称为随机6聚体、N6或dN6。该种引物不具备特异性，rRNA, tRNA,非编码RNA，小RNA，降解RNA，复杂二级结构的RNA等都可以作为其模板。该类引物可提高cDNA的产量和浓度，但是会使合成的cDNA长度变短，不适合用于长RNA的全长反转录。

基因特异性引物能够与模板特异性互补，产生目标性很强的cDNA，对于后续的PCR扩增更特异，适用于已知目的序列。通常应用于一步RT-PCR反应。当使用基因特异性引物（GSP）无法有效合成第一链cDNA时，可选用Oligo(dT)或随机引物。

不同的反转录酶具有不同的功能活性，表现出不同的反转录效率，如合成cDNA的长度，产量，对复杂模板的适应程度等。通常共有的活性如下：

目前使用的反转录酶大都为MMLV（来源于莫洛尼鼠白血病病毒）。未经改造的MMLV最适反应温度为37℃，有较低的RNaseH活性。翌圣生物对MMLV反转录酶进行改造，提高其最适反应温度（高温下有利于RNA二级结构的打开），降低RNaseH活性，提高cDNA合成长度，增强其灵敏度和耐抑制能力。改造结果见下图：

反转录酶的改造

各种反转录酶的性能参数如下表：

如今我们常购得的反转录试剂多为预混液，其中的反应缓冲液、dNTP浓度、DTT还原剂、RNA酶抑制剂通常根据反转录酶的特性，调整至最佳条件。而反应中的水则在实验中自行添加。

所采用的水最好不含有核酸酶，可使用反转录试剂附赠的商业化无核酸酶水或者经过DEPC处理去除了RNase的水。由于RNase是热稳定酶，难以通过高压高温去除，故实验室中其他的水若有核酸酶残留，将会对模板造成一定程度降解，影响实验结果。

反转录反应过程主要包括三个步骤，分别是引物退火、DNA合成和酶失活。而反应的温度、时间会因为选择的引物、RNA模板类型和所使用的反转录酶有所差异。

反转录温度通常推荐使用42℃，对于高GC含量模板或者复杂模板，使用热稳定的反转录酶，温度可提高到50~55℃。反转录产物可立即用于qPCR反应，也可-20℃短期保存；若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

总之，高效率的反转录反应建立在高质量的RNA模板、反转录酶，合适的引物，适宜的反应条件等基础上的。实验过程中要注意到所有的影响因素，才能合成出适用于下游实验的高质量cDNA。