生物制药中的内毒素控制：一个关键的质量挑战

在生物制品的生产与应用过程中，内毒素污染是一个极易被忽视却至关重要的风险因素。内毒素超标不仅严重影响产品的质量和安全性，还可能对人体造成显著危害，是生物制药领域必须严格控制的关键质量属性。

一、内毒素的致病机制

内毒素可导致严重的病理生理反应，其毒性可造成多种器官功能损伤。内毒素或损伤肝细胞导致肝功能异常，或引起肾脏血管收缩发生急性肾损伤，或影响心肌细胞功能造成心率失常或心力衰竭等。内毒素还可引起肠道菌群失衡，导致腹泻、呕吐等胃肠道症状。

这些病理变化的根本机制在于内毒素激活了人体先天免疫和适应性免疫反应，诱导大量炎症细胞分子分泌，如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IFN等。这些细胞因子通过结合受体，介导细胞间的信号通路，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程，进而调控细胞免疫应答和炎症反应。

LPS脂多糖激活先天性及适应性免疫级联反应引发疾病的机制（源自文献：DOI: 10.1111/prd.12433）

研究发现极低浓度（＜1 ng/mL）的内毒素即可刺激白细胞产生细胞因子。0.5 ng/mL的内毒素处理马腹膜巨噬细胞6小时后，显著促进IL-6表达。而用10-200 ng/mL的内毒素刺激小鼠B细胞，可诱导免疫球蛋白IgM的表达。体外实验发现，1 ng/mL的内毒素会增加大鼠主动脉环中TNF和IL-1的表达，造成收缩功能受损。同样浓度的内毒素会提高一氧化氮合酶（NOS）活性，使大鼠心肌细胞出现收缩功能障碍。

二、内毒素控制：药物研发的必要前提

内毒素诱发的免疫反应不仅威胁候选药物的安全性和有效性，更会造成实验数据失真，严重干扰抗体药物的发现和开发进程。尤其是重组蛋白中存在的内毒素，可能会对药物开发工作产生深远的影响。

对动物免疫的干扰

在动物免疫或体内实验中，内毒素引发的炎症反应可导致实验动物发生内毒素血症，导致无法进行下一步工作，使整个研究失效。内毒素与巨噬细胞和树突状细胞的表面受体TLR4结合，产生的促炎细胞因子，并非靶点蛋白诱导，这会掩盖抗体药物的真实药效和毒性，会造成实验结果出现误差或误判，影响后续临床剂量设计及安全性评估。

对体外实验的干扰

样品中残留的内毒素可能会刺激细胞产生非特异性激活，如诱导凋亡、增强炎症信号、细胞增殖状态异常，出现假阳性结果。这些结果可能被误认为是抗体药物的活性，或者掩盖实际治疗试剂/抗原产生的微妙、特异性的信号，导致数据误读，最终对候选药物作用机制得出不准确的结论。

交叉污染风险

内毒素可吸附在多种实验材料表面，如离心管、层析树脂、玻璃容器等，导致实验间出现交叉污染。

三、内毒素控制的策略

在抗体药物研发或生物制品生产中，原料、原辅材料、培养基、生产环境、设备及器械等，都可能成为内毒素的来源。因此控制内毒素污染的关键措施是对产品生产全过程进行控制。比如对设备、管路实行在位清洗（CIP）或在位灭菌（SIP），使用无内毒素的缓冲液、注射用水及低内毒素吸附塑料器皿。严格按照GMP要求进行生产，严格无菌操作。

内毒素耐热、耐酸碱。常规湿热灭菌法（121℃）不能破坏内毒素，有效的方法是灭菌法。一般为180℃ 3-4h、200℃ 60min或250℃ 30-40min。或用强碱强酸灭活内毒素，0.2M NaOH或HCl浸泡4h以上。

四、超低内毒素蛋白在生物制药中的关键作用

重组蛋白是生物医学研究和药物开发过程中不可或缺的基础工具，广泛应用于药物功能研究、机制分析、抗体发现和动物免疫等关键环节。内毒素含量是重组蛋白的重要质量控制指标之一。即使痕量内毒素残留，也可能触发免疫反应，干扰实验结果，导致实验数据偏差。

多项研究已正式内毒素对免疫细胞具有极高的生物学敏感性。例如，Ratthakorn团队研究发现，极低浓度LPS（0.0025 ng/mL和0.005 ng/mL）即可分别诱导单核细胞产生TNF-α和IL-6。这一结果显示，在涉及单核细胞的研究中，即便是极低水平的内毒素污染也可能诱发细胞因子释放。因此，用于免疫功能研究的重组蛋白必须采用高灵敏度方法检测内毒素残留，并确保其处于低于定量限的水平。超低内毒素重组蛋白的应用，对于降低实验背景噪音、提高数据可信度以及加速候选药物的科学决策，具有重要意义。

极低浓度脂多糖即可诱导单核细胞产生TNF-α与IL-6

（源自文献： doi：10.1186/s13104-022-05941-4）

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参考文献：

Pirkko J. Pussinen, et al. Periodontitis and cardiometabolic disorders: The role of lipopolysaccharide and endotoxemia. Periodontology 2000. DOI: 10.1111/prd.12433

Ratthakorn Chaiwut and Watchara Kasinrerk. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes, 2022. https://doi.org/10.1186/s13104-022-05941-4