精品推荐 | 合成生物学新秀：末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)

2025-05-09 14:00:20 9阅读次数

扫码分享

前言

在分子生物学实验室中，DNA聚合酶是构建遗传物质的“建筑师”，但大多数聚合酶依赖模板链进行精准复制。而Terminal Deoxynucleotidyl Transferase（TdT，末端脱氧核苷酸转移酶）却打破了这一规则。作为DNA聚合酶第十家族（Pol X）的独特成员，TdT具有不依赖模板的DNA合成能力，这一特性使得它在许多领域展现出巨大的应用潜力，例如作为分子生物学工具用于基因突变和载体构建、开发基于TdT的生物传感器用于疾病和金属含量检测、在DNA微阵列领域进行基因表达分析和microRNA检测、基于DNA的新一代信息存储技术、酶法从头合成DNA技术等。

本文将从TdT的生化特性、核心应用场景展开论述，探讨末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在分子生物学中的价值。

TdT的生化特性

无模板合成的“分子魔术师”

结构基础与催化机制

TdT的催化核心由四个结构域组成，整体呈“右手”状构象，与DNA聚合酶β（Pol β）的同源结构域高度相似。其活性中心包含两个关键基序：ALLGW（T/S）GSR和TGGFRRG。前者通过“打开-关闭”构象转变调节底物结合，后者则依赖精氨酸残基稳定催化反应。双金属催化机制（通常为Mn2?或Co2?）是TdT的核心特征：金属A（如Co2?）在底物结合阶段暂时参与，金属B（如Mg2?）则持续稳定催化中心。这种机制使TdT能高效识别含至少3个碱基的引物链，甚至对六乙二醇修饰的短链也具有活性。

图1.TdT催化的反应

底物兼容性与反应条件

TdT的底物谱广泛，涵盖单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）及部分RNA分子。实验显示，其对平末端DNA的催化效率显著高于模板依赖型聚合酶，且对修饰核苷酸（如ddNTP、DIG-dUTP）具有高度兼容性。典型反应条件为37℃、60分钟，1个活性单位定义为在上述条件下催化1 nmol dNTP掺入DNA的酶量。值得注意的是，高浓度铵根离子、氯离子及EDTA会抑制其活性，而Co2?的添加可提升对平末端的催化效率达3倍以上。

生理功能与免疫应答关联

TdT作为诱变因子参与免疫球蛋白和T细胞受体蛋白基因多样性形成，该过程发生在表达TdT的前淋巴细胞，在这些细胞里TdT随机添加大约1-10个核苷酸到基因编码区末端，从而增加了免疫组库的多样性(图2)。值得注意的是，TdT在V(D)J重组中发挥作用需要DNA修复途径的其他酶(如KU80和XRCC4)协助，然后被招募到V(D)J重组复合体。研究表明，敲除TdT基因的小鼠体内TCR库多样性降低70%，验证了其在免疫应答中的核心作用。

图2 .TdT的生物学功能

TdT的核心应用场景

从基础研究到工业应用

基因工程与载体构建

TdT在基因工程中的经典应用是“同聚物加尾法”。通过在载体DNA的3'末端添加dATP或dTTP尾链，与互补的外源DNA片段退火连接，可高效构建重组质粒。例如，在cDNA文库构建中，TdT介导的加尾反应使mRNA的3'末端获得poly（A）尾链，从而与含poly（T）的载体特异性结合，提升克隆效率。此外，在RACE（快速扩增cDNA末端）技术中，TdT通过添加随机核苷酸尾链，为后续PCR提供引物结合位点，实现全长cDNA的捕获。

图3 .使用TdT合成DNA

TUNEL技术

细胞凋亡发生时，相关DNA内切酶会被激活，从而切断核小体间的DNA。在细胞凋亡晚期，DNA会被降解为180-200 bp的片段。 TdT介导的dUTP末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）是在TdT的催化下将荧光素标记的dUTP（fluorescein-dUTP）与断裂DNA暴露的3'-OH聚合，延伸后的DNA可通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。临床研究显示，TUNEL在急性淋巴细胞白血病（ALL）诊断中具有特异性。ALL患者骨髓样本的TdT阳性率达95%，而成熟淋巴细胞呈阴性，为疾病分型和预后评估提供关键依据。

图4 .TdT标记细胞凋亡

DNA甲基化测序的“接头工程师”

在全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）中，TdT通过添加同聚物尾链实现ssDNA与接头的连接。具体流程为：

重亚硫酸盐（Bisulfite）处理DNA，使未甲基化修饰的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，变性为ssDNA。
3′接头连接，TdT末端转移酶参与目的DNA 3′端添加接头的过程，催化ssDNA的3′羟基端加上同聚物尾巴（示意图中橙色曲线部分），从而在连接酶的作用下与接头进行连接。
DNA二链合成，5′接头连接。
PCR扩增获取含有完整接头序列的上机文库。

图5. DNA甲基化建库流程

酶促法DNA合成的“基石”

TdT在DNA从头合成技术中占据核心地位。基于其非模板依赖特性，研究者开发出两种策略：

Type I策略：将dNTP的碱基部分通过连接物（linker）与TdT共价连接，形成TdT-dNTP耦合物。耦合物催化引物DNA延伸一个碱基后，产物DNA仍与TdT共价结合，阻碍后续添加。通过物理、化学或生物方法切断连接物，释放产物DNA，进入下一循环。
Type II策略：使用3'-OH端带有可逆保护基团的dNTP（如RTdNTPs）。TdT催化RTdNTP添加至引物DNA后，产物DNA因3'-端被保护而无法继续延伸。通过脱保护步骤去除保护基团，恢复3'-OH，进入下一循环。

DNA微阵列技术

TdT酶（末端脱氧核苷酸转移酶）在DNA微阵列技术中主要应用于单链DNA文库构建及探针标记优化，通过其非模板依赖的末端延伸特性提升杂交效率与信号强度，同时助力DNA序列的定向修饰，为微阵列检测的灵敏度和特异性提供关键支持。

TdT作为分子生物学工具中的“非模板革命者”，其应用已从基因工程基础技术延伸至临床诊断和合成生物学前沿。随着酶工程改造技术的进步，TdT的稳定性、底物兼容性和催化效率将持续优化，为DNA测序、疾病标志物开发及DNA存储技术提供更强动力。未来，TdT有望成为连接基础研究与临床转化的关键桥梁，推动生命科学进入精准调控的新纪元。

现在翌圣重磅推出具有低残留、高纯度的特点的TdT末端转移酶，高效进行DNA末端的同聚物加尾。适用于各种应用场景。

性能展示

无切口酶残留

切口酶残留结果：跑胶结果显示两批次TdT末端转移酶与阴性对照（C）一致，显示无切口酶残留。

无核酸外切酶残留

核酸外切酶残留结果：跑胶结果显示两批次TdT末端转移酶与阴性对照（C）一致，显示无核酸外切酶酶残留。

产品推荐

参考文献：

Chengjie Zhang, et,al.Terminal deoxynucleotidyl transferase: Properties and applications,Engineering Microbiology , Volume 5, Issue 1 , 2025,100179, ISSN 2667-3703.

#Terminal Deoxynucleotidyl Transferase #TdT #末端脱氧核苷酸转移酶

翌圣生物

翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力，核心产品数量达数千种，覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。