纯干货！显色示踪荧光定量相对定量操作解析

1.cDNA样本：通过上游反转录反应得到的cDNA。
2.荧光定量试剂：Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No/Low/High Rox)。
3.其他试剂：RNase-free H₂O、相关基因上下游引物(储存浓度10 μM)。
4.设备与耗材：移液器、qPCR仪、冰盒、离心机、RNase-free八连排、RNase-free离心管。

Tips：混匀时尽量避免产生气泡，气泡可能会影响酶的活性或实验结果的准确性。

常见的荧光定量仪器为96孔反应，大体分为12列×8行。举例说明：

备注说明：

以上述投入2μL cDNA模板检测不同样本基因1为例：

将上述溶液依次加好后，将管盖盖严，用手轻弹管壁，使各组分充分混匀，再放入小型离心机，短暂离心1-2s，再次轻弹管壁（防止有气泡），瞬间离心（防止部分溶液沾到管壁上）并置于冰/冰板上。

备注：如使用显踪剂建议模板投入体积控制在2-5 μL，以保证显踪效果，如使用cDNA母液建议投入体积控制在2 μL(反应体系的1/10)以内防止影响扩增效果。

备注：注意观察每一枪是否吸到了气泡，若出现气泡吸取则会导致实验数据出现较大偏差。

上机前，仔细检查管子，确保正上方管盖、管身没有记号笔染料，管内无气泡、管壁无液体。

若采用常规程序，则进行以下设置：

备注：
不同荧光定量qPCR试剂核心的酶和Buffer组成都存在差异，对应说明书上的程序是该产品大多数情况下的最适反应条件，建议按照说明书的程序进行仪器设置，减少因用其他程序带来的数据偏差；
熔解曲线程序可选用仪器默认程序。

备注：以ABI Q5常规程序为例，在进行程序设置时，确保在退火/延伸阶段和熔解曲线的升温阶段打开数据信号收集开关。

若采用快速程序，需确认仪器本身是否可以快速升降温，运行快速程序。以下以ABI Q5为例：

下机得到的Excel数据处理如下：

图示说明：

④：对照组校正后的数值；

③/④：每个小组校正后的数值比上对照组校正后的数值；

意图表上的数据在excel中采用了保留2位小数的形式，实际计算时不可忽略小数点后的所有数字，减少按数字的动作，活用Excel。

1、引物设计好坏对于最终实验的成功和实验结果都会有一定的影响，可参考干货软文，解锁更多引物设计宝藏。

2、长时间放置的引物，建议尝试先用预实验(跟着其他实验或人带上几孔测测看)，避免直接进行大规模正式实验，从而造成不必要的风险损失。