智荟专线快问快答｜离子交换篇

图1 离子交换层析（IEX）实验步骤与层析图谱

以蛋白质为例，当所处buffer的pH值低于其等电点（isoelectric point, pI）时，蛋白容易获得质子带正电荷，可以与阳离子交换填料上带负电的配基结合；

当pH值高于其等电点时，蛋白失去质子带负电荷，可以与阴离子交换填料上带正电的配基结合。

如果蛋白质氨基酸序列已知，我们可以使用Expasy、DNAMAN等在线工具预测pI，但是该预测只参考一级结构，不看空间结构，因此是个理论值。

如果序列未知，可以通过等电聚焦或者蛋白滴定曲线来确定其pI，比一级结构预测更准确。也可以参考文献和数据库中的pI。
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表1 阴离子交换配基的种类和结构

强离子交换与弱离子交换的差异在于强的为完全电离，弱的为部分电离。

强的在较宽的pH范围内有着比较好的载量，而弱的会随pH的不同，结合的强度与载量有改变，所以能提供更多的选择性。一般推荐先尝试强离子交换，在选择性不好的时候可以再尝试弱离子交换。以Q和DEAE填料的滴定曲线举例，如图2所示：

图2 Q和DEAE填料的滴定曲线

图3 基架粒径的大小-粒径越小，分辨率越高，反压越大

图4 Capto/Capto ImpAct表面引入了延展臂或惰性间隔物

与Sepharose基架相比，在相同的压力下，Capto的线性流速更高。图5是20℃条件下，装柱直径1米，不同装填高度下的水流速，Capto填料能装填更高的柱床高度，依然可以获得非常好的流速。

所以Capto填料流速压力曲线好，节省操作时间，性能稳定，便于直接优化和工艺放大。

图5 Capto基架耐压性测试

图6 Capto基架耐碱性测试

载量需要测试。动态结合载量（Dynamic Binding Capacity，DBC）是在实际样品操作条件下的结合能力。例如，对于离子交换层析，DBC依赖于溶液pH、离子强度、添加剂以及样品本身的性质。

另外，流速也会影响动态结合载量，一般来说，流速越低，动态结合载量越高，如果流速接近于零，动态结合载量等于静态结合载量。

层析填料的DBC是在给定流速条件下发生未结合蛋白显著穿透之前结合的目标蛋白量，通过绘制蛋白上样量与穿透百分比的曲线生成穿透曲线。DBC可在穿透曲线上测定，例如损失10%蛋白质（称为QB10 值），请参考下方内容。

在进行离子交换层析实验时所用buffer的pH值，建议偏离样品等电点1个pH值以上，不建议选择太酸或者太碱的buffer体系，会影响样品的功能活性。

由于离子交换结合条件取决于目标分子表面带电荷情况，所以等电点仅为参考。buffer的pH值与分离方式（结合洗脱or流穿模式）的选择，请参考图7：

图7 缓冲液pH值的确定

中间线净电荷为0，代表等电点，当蛋白所处buffer的pH值＜pI时，蛋白带正电荷，当所处buffer的pH值＞pI时，蛋白带负电荷。

以红绿蓝代表的三个蛋白为例，红绿两个蛋白的pI偏向5，蓝色蛋白的pI接近7，为了分离得到蓝色的蛋白，我们可以选择pH 6的buffer，让蓝色蛋白带正电荷，红绿带负电荷，这时选择阳离子交换层析，可以让蓝色蛋白结合、绿色和红色蛋白流穿，从而实现分离。

如果选择了pH 5的buffer时，三个蛋白都带正电荷，此时选择阳离子交换层析，三种蛋白都能挂柱，但是红绿带电荷量偏少且相等，所以红绿会被先洗脱下来，而蓝色蛋白带电量多、与填料结合更紧密，需要更强的洗脱条件才能洗脱，所以后被洗脱下来，也能实现分离。

从图中还可以看到红绿两个蛋白的pI很接近，如果pH摸索的好，找到二者滴定曲线差异大的pH，让两者电荷差异明显，也能够较好的分离。反过来，也可能出现：两个蛋白，一个pI 5.5，一个pI 7，但是某pH条件下（红蓝曲线交叉处），带电性质一样，又分不开。所以buffer的pH是离子交换层析的关键参数。

图8 利用?KTA系统的Scouting功能筛选pH

表3 适用于阴离子交换的非挥发性缓冲体系

在配制缓冲液时一定要注意高盐的洗脱液在添加1 M NaCl后需要再调一次pH值。如图9所示，左图buffer A添加1 M NaCl后回调了pH值，右图没有调整，拉线性梯度洗脱时两者出峰情况不同。

pH值也称氢离子浓度指数，当溶液中离子强度增加时，氢离子的电离也会发生改变，通过pH在线检测，我们发现加完高浓度的NaCl，溶液的pH值会发生变化，由于样品的带电情况与pH值息息相关，所以在拉线性梯度洗脱时，pH的改变会影响最终分离的结果。另外，温度也会显著地影响溶液的pH值，随着温度的升高pH值会降低，所以请在恒定的温度下进行实验。

图9 缓冲液配置方法的不同，也会影响pH的准确性

建议优先选择不带电荷的中性去垢剂，比如Triton X-100, NP-40, DDM等。不能选择相同类型的去垢剂，比如阴离子型表面活性剂SDS是带有强负电的小分子，它会大量吸附在带正电的阴离子填料上，占据结合位点，影响样品结合。

在离子交换层析中，样品的结合是可逆的，能通过更强的离子竞争洗脱，但SDS的结合已经很强了，很难再被洗脱下来，如果它一直结合在填料上，导致样品没有了结合位点，那么填料就报废了。

一般选择盐梯度洗脱，可以选择线性洗脱或者步级洗脱。如果是预实验，建议先进行线性洗脱，每个梯度运行10-20 CV，基于线性梯度洗脱的结果，再进一步将洗脱条件优化为步级洗脱，以缩短实验时间、提高样品浓度。线性梯度越缓、线性越长，分辨率越高，但是对应的峰也越宽。

另外，也可以选择复杂的线性洗脱模式，针对分辨率不好的区间，尤其是包含目标物的区间，可以将梯度拉缓一些，提高分辨率。在IEX中，pH洗脱方式并不常见，因为有些蛋白在pH接近其pI时易沉淀，造成层析柱堵塞，洗脱pH也将改变溶液的离子强度，影响实验过程的重现性。

自然界中绝大部分蛋白的pI值在5.8或9附近，偏酸性更多。因此，针对未知样品，一般首先推荐强阴离子交换层析，如Capto Q，使用中性缓冲液pH 7-8。如果Q挂不上，可以再尝试强阳离子交换Capto S或SP，选择pH 5-6范围。

另外，可以选择样品流穿，杂质挂柱。HiTrap Capto IEX Selection Kit（货号28934388），含Capto S、Capto Q、Capto DEAE、Capto adhere以及Capto MMC 1 mL预装柱各一支，后两个为多模式填料，可用于填料筛选。

色素性质较复杂，可以根据填料的耐受情况，尝试使用高盐、NaOH、有机溶剂（如 30%异丙醇）或酸（如醋酸）处理。

除了单一的清洗方式，也可以考虑使用混合试剂进行处理。如果0.5-1.0 M NaOH清洗效果不佳，可以分别尝试如下清洗方式：

表5 IEX填料pH稳定范围以及推荐的储存溶液

层析介质的清洁程序 

?看似简单的话题：层析柱如何正确保存？