随着生物药行业发展，便捷高效，副作用小的皮下注射的给药方式越来越受到患者的青睐。
同时对于药企而言，皮下注射也是突破同质化竞争和提高患者依从性的重要方法。为了减轻皮下注射的疼痛，药物会做成小剂量的高浓度蛋白制剂。
通常，通过修饰注射部位、低粘度配方制剂、保护性复合微球/珠等方法可减轻高浓制剂皮下注射引起的疼痛，并提高药物的利用度1。
在上述方法中，修饰注射部位的方法尤为引人瞩目，该方法一般使用重组人透明质酸酶与药物做成复方制剂，重组人透明质酸酶可以降解注射部位皮肤中的透明质酸，降低细胞间质的粘性，显著增加皮下给药的最大注射量（图1）。使得药物快速进入体内，大大缩短给药时间，同时还可降低给药频率。
目前FDA已经批准8款含重组人透明质酸酶的皮下制剂抗体药上市，其中就有如利妥昔单抗，曲妥珠单抗和达雷妥尤单抗等药物。
表1：皮下注射高浓制剂药物的配方/方法
图1：透明质酸酶的作用机制
Halozyme公司作为重组人透明质酸酶领头羊企业，其ENHANZE药物递送技术2已经在上述上市药物中有广泛应用。
在Halozyme公开的专利中可以看到，重组人透明质酸酶使用CHO DG44细胞作为生产宿主细胞3。
而选择CHO细胞作为表达系统的原因如下：
人源和牛源的透明质酸酶有500多个氨基酸序列一致，而在470位点氨基酸极其残基上有较大差异。
此外，人透明质酸酶含有额外8个半胱氨酸残基（共12个），且残基具有多个N-糖基化位点。但是，重组表达的可溶性牛透明质酸酶的酶活性极低（可能是大肠杆菌表达）。
因此更复杂的人源透明质酸酶只能由可进行更高级蛋白翻译后修饰的哺乳动物细胞，如CHO细胞来进行表达。
下面我们以Halozyme公司100 L CHO DG44细胞生产工艺为例3，浅探序列优化至上游细胞培养工艺路线。
重组人透明质酸酶的分子改造
一般而言，人源透明质酸酶主要以亲水性氨基酸锚定在细胞质膜，在磷脂酶C催化后细胞产生酸性环境中透明质酸酶才具有活性。
先前研究中通过缺失突变可能的糖基磷脂酰肌醇位点（活性蛋白与细胞膜的结合方式）旁侧的羧基也并未获得理想的酶活性。
本次研究中，研究者通过缺失突变477-483位点氨基酸的羧基（图2），使得重组人透明质酸酶在中性环境中即可发挥作用。
图2：缺失突变477-483位点氨基酸的羧基
CHO DG44细胞转染和培养
将上述人透明质酸酶cDNA转染至CHO DG44细胞中，通过加压筛选出高表达的阳性克隆并将其接种至化学成分限定培养基中。
经四步层析后，可获得比活超过100,000 USP Units/mg 蛋白的重组人透明质酸酶，且可完整表达6处N-glycan修饰。
随后细胞扩种建立WCB进行100 L反应器生产，培养周期持续两周，经纯化浓缩后的重组人透明质酸酶的比活比商业的动物源透明质酸酶比活高出50至100倍（数据未展示）。
通过测试浊度，粘度或者还原后糖量可以判断重组人透明质酸酶对糖胺聚糖的作用，本次研究中，将脐带透明质酸与1单位的重组人透明质酸酶孵育至特定时间，然后电泳分离透明质酸的消化产物，从图3中可以看出，即使是纳克级别的重组人透明质酸酶也具有很好的酶消化效果。
图3：β 1–4内切糖苷酶介导的重组人透明质酸酶对高分子量透明质酸的解聚
目前国内也在重组人透明质酸酶赛道快速赶超，使用的CHO细胞亚型更加丰富，培养工艺愈发先进。
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HyClone作为旗下培养基子品牌，在CHO培养基领域深耕多年，旗下有“王牌产品”ActiPro+7ab组合以及其他培养基，为细胞高表达保驾护航。
此外，在重组人透明质酸酶纯化和过滤工艺中也有相应产品和技术支持。
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参考文献：
1.Collins D ,Manuel Sánchez-Félix, Badkar A V ,et al.Accelerating the development of novel technologies and tools for the subcutaneous delivery of biotherapeutics[J].Journal of Controlled Release, 2020, 321.DOI:10.1016/j.jconrel.2020.02.036.
2.Kenneth W ,Locke, Daniel C ,et al.ENHANZE? drug delivery technology: a novel approach to subcutaneous administration using recombinant human hyaluronidase PH20[J].Drug delivery, 2019.DOI:10.1080/10717544.2018.1551442.
3.Frost G I .Recombinant human hyaluronidase (rHuPH20): An enabling platform for subcutaneous drug and fluid administration[J].Expert Opinion on Drug Delivery, 2007, 4(4):427-440.DOI:10.1517/17425247.4.4.427.
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