双荧光素酶实验的原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。同时，为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
萤火虫荧光素酶检测原理图以及海肾荧光素酶原理图
实验原理图
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单荧光素酶检测系统只有萤火虫荧光素酶，该实验往往会受到各种实验条件的影响。而双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引入了海肾荧光素酶基因作为内参基因，将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。因为其底物跟发光波长不同，萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，相当于做了标准化，使测试结果不受实验条件变化的干扰。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值除以海肾荧光素酶检测值即可。
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荧光素酶报告基因检测试剂盒
（一）验证microRNA同某基因mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
（二） 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测荧光素酶活性。
（三） 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。
（四） 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。
（五） 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。
（六） 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。
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