干货 | 双荧光素酶验证miRNA 与靶基因3’UTR 相互作用！

翌圣双荧光素酶报告基因检测服务流程：

目的细胞质粒瞬转预实验

当选择在目的细胞（而非293 工具细胞）中进行验证实验时，首先要确认目的细胞的质粒瞬转效率，以及摸索合适的瞬转体系，质粒瞬转效率>40%以上时表明预实验通过。

转染正式实验

a. 将状态良好，处于对数生长期的空白细胞用0.25%胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，接种于24 孔培养板中；

b. 培养过夜，观察细胞生长状态。在细胞覆盖率70%左右时，进行转染实验；

c. 转染2 h 前换液为新鲜的培养基；

d. 转染取无菌的1.5 mL EP 管，转染参考转染试剂使用说明书；

e. 转染48 h 后收集细胞样品。

A 细胞样品收集

a. 转染后从培养箱中取靶细胞，轻轻吸净培养液，PBS 洗涤2 次；

b. 弃去PBS，每孔加入100 μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用无菌水稀释而得）；

c. 细胞裂解后，将样品转移入EP 管中，-80 度冰箱保存。

B 根据报告基因检测试剂盒说明书操作进行检测

a. 将充分裂解后的裂解产物，10,000-15,000 rpm 离心3-5 min。离心后将上清液移入新的

EP 管进行后续检测。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照样品要求的量，将Renilla Luciferase Assay

Reagent(100×)按照稀释比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混匀后室温放置。

c. 荧光素酶检测

按照仪器说明书要求将荧光检测打开，设定参数，测定时间为10 s，测定间隔为2 s；

将样品按照20 μL 的体积加入测量管中（保持每次样品的加样量一致），

另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混匀2-3 次（不能漩涡混匀），充分混匀后

测定RLU（Relative light unit），同时设置Cell Lysis buffer 为空白对照孔；

将检测后的样品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混匀2-3 次，充分

混匀后测定RLU，同时设置Renilla Luciferase Assay 工作液为空白对照孔。