CHO细胞中乳酸代谢机理和调控策略

图1：细胞生长的不同时期乳酸的代谢路径

一种是单羧酸转运蛋白 (MCT) ，乳酸和H⁺通过该蛋白共转运出入细胞；

另一种是乳酸脱氢酶 (LDH) ，将乳酸转化为丙酮酸，使其进入三羧酸循环（图2）。乳酸代谢的转换受细胞内、外乳酸浓度差和跨膜质子梯度的调节的影响。

图2：乳酸的代谢示意图

图3：三种常见的Fed-Batch乳酸代谢趋势图

图4：减少哺乳动物细胞生物过程中乳酸产生的主要策略

采用代谢相对缓慢的碳源替代培养基中的葡萄糖和谷氨酰胺，比如利用果糖、麦芽糖和半乳糖替代葡萄糖，利用谷氨酸、丙酮酸、三羧酸循环中间体等替代谷氨酰胺来减缓乳酸的积累。有研究表明，用半乳糖替代葡萄糖，产生的乳酸显著减少，但降低了特定的细胞生长速率和峰值活细胞密度。为了提高细胞生物代谢，在补料分批培养的中，使用一种双相培养策略（交替葡萄糖和半乳糖消耗），乳酸积累显著减少，半乳糖化一定程度上改善。

将葡萄糖维持在较低水平，从而降低糖酵解的通量和减少乳酸的生成，但同时需要考虑缺乏葡萄糖是否对糖基化修饰的影响。HyClone可提供无糖Cell Boost 7A作为补料，方便控制流加培养中葡萄糖的浓度。

Freund等报道了一种乳酸补充和适应 (LSA) 技术，该培养基和补料设计推动代谢平衡向乳酸消耗表型发展，在该技术中，CHO细胞适应了补充乳酸钠的培养基，既为细胞提供能量，同时控制培养物pH。该技术应用于Fed-Batch培养时，乳酸浓度下降8倍，活细胞浓度达到35M cells/ml。

补充铜离子，在铜缺乏的体系补充，铜离子可有效改善乳酸异常积累，铜离子不宜过度添加，容易造成碱性异构体，Man5和聚体的增加。

图5：不同基础培养基中细胞乳酸代谢的对比

采用pH上限控糖法 (HIPDOG) 即基于pH变化调节葡萄糖流加量，当细胞培养中乳酸代谢由积累转变为消耗时，pH会上升，此时缓慢流加葡萄糖，使细胞产生少量乳酸，则pH会有所下降。之后，停止流加葡萄糖，使葡萄糖浓度下降，乳酸则会被消耗，进而使pH回升（如图6），采用HIPDOG的CHO流加培养工艺由于对乳酸的有效抑制，在产量和稳定性方面表现出了显著的提高。

图6：利用HIPDOG方法调整葡萄糖的流加策略

降低培养温度和pH，在补料批培养中，观察到特定乳酸生产率与pH和温度的设定值之间存在线性相关性。有研究表明温度降低会减缓细胞代谢，葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸的产生都会减少。也有研究表明，pH设定值的降低，引起糖酵解酶活性和膜电位发生变化，从而导致葡萄糖消耗和乳酸产生减少。然而，由于这两种策略都会对细胞增殖、蛋白产量和糖基化产生不利影响，因此在PH和温度的双相培养调整中，乳酸代谢会根据具体情况进行优化，比如在不影响产品产量和质量的前提下，pH在小范围调整，温度在降温时间点和降温度数进行优化。

改善传质，在大型生物反应器中也可能出现乳酸代谢不一致的情况时，可能是高pCO?累积造成线粒体功能下降，从而阻止CHO细胞培养中从乳酸生产转变为乳酸消耗的正常转换。改善传质可以改善细胞代谢，减少二氧化碳的积累，促使乳酸从积累到消耗转变，另外改善传质时关注过高的搅拌速率和通气带来的剪切力。

更换细胞株，在单克隆筛选中需要考虑乳酸代谢的影响，以免在工艺放大中出现风险。

降低葡萄糖消耗和乳酸生成速率，如下调乳酸脱氢酶LDH基因或上调抗凋亡基因BCL-2A的表达改善线粒体的活性。

促进丙酮酸进入TCA循环，如上调丙酮酸羧化酶PYC和丙酮酸脱氢酶PDH的活性或抑制丙酮酸脱氢酶激酶PDK活性，上调苹果酸脱氢酶MDH等

改善其他糖类代谢速率，可以选择提高果糖转运体GLU5以提高细胞消耗果糖的速率，并以果糖代替葡萄糖。