【THUNDER小课堂】脑神经发育

整个小鼠胚胎的图像：（左）原始宽场成像结果和（右）应用Large Volume Computational Clearing（LVCC）后的成像结果。图片来源：A. Popratiloff和Z. Motahari，美国乔治·华盛顿大学。

本文介绍了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）对小鼠胚胎快速、高对比度成像，实现了对轴突生长和脑神经发育的研究。许多在发育早期阶段损害神经回路发育的遗传性疾病被认为会对行为造成干扰。用小鼠模型研究早期神经发育的细胞变化、定义与人类疾病相似的行为及潜在发育机制，是非常困难的。而鉴别发育的神经元回路中三叉神经（其参与面部感觉和运动机能）轴突生长的早期分化，使得这些困难迎刃而解。

简介

人们普遍认为，很多遗传性疾病都通过损害神经回路发育的早期阶段来对行为产生干扰[1]。事实证明，在模型动物中分辨早期神经发育中细胞的此类变化具有一定的难度。用与人类遗传性疾病中临床显著缺陷相似的基因突变小鼠模型来定义行为、神经回路和潜在发育机制，是非常困难的[1]。检测单个神经元初始分化中的变化难以实现。这些挑战可通过确定发育的神经回路中三叉神经这一关键组分的轴突生长的早期分化来解决[1]。通过着眼于参与面部感觉及运动机能如哺乳、进食、咬、咀嚼和吞咽等的三叉神经（脑神经V），以及轴突生长和原生传导通路，可以对使用组织学处理可能会缺失的三维环境进行研究[1]。本文介绍如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]对小鼠胚胎快速、高对比度成像，以帮助进行脑神经发育研究。

挑战

如要以实用高效的方式对整个小鼠胚胎成像，快速、清晰的高对比度3D成像解决方案，对于重要细节展示和解析大有益处。相较于激光共聚焦成像，可在很短的时间内一次性采集到完整胚胎的成像结果。传统宽场显微成像速度快，检测灵敏度高，但是对厚标本的成像，如小鼠胚胎，通常会由于非焦平面信号的影响，呈现模糊的成像结果，降低图像对比度[2,3]。

方法

使用THUNDER Imager 3D Cell Culture对小鼠胚胎成像。使用抗βIII微管蛋白（Tuj1）抗体对胚胎的神经系统和脑神经进行染色。结合BABB透明化处理，即可对整个胚胎中的神经系统进行三维结构成像。图1中的图像使用数值孔径（NA）0.75、工作距离700μm的20x多浸液物镜采集。该图像由32个视野拼接组成，成像深度为672 μm（337层切），采集了完整的胚胎结构。数据采集总时长为18分钟。

结果

通过LVCC和Instant Computational Clearing（ICC）将宽场成像固有的非焦面模糊信号清除[2,3]。之后，再使用徕卡自适应式反卷积技术来增强三维特征结构的分辨率[4]。这种成像模式便于观察胚胎的神经结构以及胚胎的整体布局中更有价值的神经元定位。

图1：展示整个小鼠胚胎的俯视图，显示原始数据（A）与应用LVCC后（B）的差异。根据相对物镜深度进行颜色标识的胚胎的角度视图，其中zui大深度为672 μm。C）应用LVCC后的脑部侧视图，显示了沿Z轴方向的精密细节。图片来源：Anastas Popratiloff博士和Zahra Motahari博士，乔治·华盛顿大学纳米制造与成像中心（GWNIC），美国华盛顿特区。

结论

与传统的宽场成像不同，THUNDER技术Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2,3]在对小鼠胚胎中的脑神经发育成像时，显著增强了图像对比度，对精密细节有更好的解析。

References：

1.Z. Motahari, T.M. Maynard, A. Popratiloff, S.A. Moody, A.-S. LaMantia, Aberrant early growth of individual trigeminal sensory and motor axons in a series of mouse genetic models of 22q11.2 deletion syndrome, Human Molecular Genetics (2020) vol. 29, iss. 18, pp. 3081-3093, DOI: 10.1093/hmg/ddaa199.

2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.

3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

4.V. Kohli, J.M. Marr, O. Schlicker, L. Felts, The Power of Pairing Adaptive Deconvolution with Computational Clearing: Technical Brief, Science Lab (2021) Leica Microsystems. 

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