一、酸性峰：潜在CQA的“高危区”
形成机制更复杂、更难预测
酸性峰由Asn/Gln脱酰胺、Met/Trp氧化、糖化、唾液酸缺失、二硫键还原/错配等多重PTM叠加而成，且随pH↓、乳酸↑、DO↓ 等工艺波动呈非线性放大。
对安全性/有效性影响更直接
脱酰胺位点若落在CDR区，可导致结合活性下降；
唾液酸缺失加速体内清除，半衰期缩短；
氧化/还原诱发聚集，免疫原性风险随之升高。
二、碱性峰：影响相对轻微
修饰位点远离活性中心
碱性峰主要源于C-末端赖氨酸残存或N-末端焦谷氨酸不完全环化，位于Fc/框架区，对结合表位影响极小。
三、酸性电荷变体的调控策略
在以下测试中[1]，实验人员先用FMEA分析和评估生产培养中影响单抗滴度和质量属性的所有工艺参数的风险。基于已建立的科学知识和对单抗滴度和质量属性的实验知识对每个工艺参数根据三个因素进行评估：影响严重程度、发生概率、以及可探测性（表1)。
表1：Results of failure mode and effects analysis
of the production culture step
每个风险优先级数（RPN）通过将影响严重程度乘以发生的概率，以及可探测性进行确定。内部专家确定RPN阈值为20。选取RPN大于20的初始活细胞密度、pH、温度变化、补料速率、补料时间、初始培养基浓度、渗透压和溶解氧水平这八个因素进一步评估。
通过12次运行的Plackett-Burman设计，分析了这八个因素对酸性电荷变体含量的影响。通过将每个因素从低值（-1）移至高值（+1），同时对这些因素进行检验（表2）；在12次试验中，各因子的高低水平组合按Plackett-Burman矩阵设定（见表3）。
表2：Details of factors selected for the experimental design
其中，某一测试水平（–1或+1）被选定为该工艺的设定点，而另一水平则作为FMEA表征范围的上限或下限。在设定上下限时，我们优先选择预期对单抗滴度和质量属性产生更积极影响的边界值。每次运行后均测定酸性电荷变体的含量（见表3最后一列）。
表3：Plackett-Burman design
and resulting contents of acidic charge variants
JMP分析结果显示，只有温度变化对酸性电荷变体的含量有显著影响（P<0.05）（表4）。因此，和其他因素相比温度变化对酸性电荷变体含量的影响更为关键，基于此进行进一步的研究。
表4：Statistical analysis results for Plackett-Burman design
如图2所示，在1 L反应器中以初始温度37 ℃和初始密度2.0×105 cells/mL进行培养。为了确定温度变化对CHO细胞生长、单抗滴度和酸性电荷变体含量的影响，对照组恒温37 ℃培养，实验组在第5天将温度分别降到33 ℃或35 ℃一直保持到培养结束。
重点观察不同培养温度下酸性电荷变体的含量（图1C）可以发现，第14天对照组和实验组35 ℃、33 ℃下的酸性电荷变体含量分别为40%、30%和22%。由此得出降低培养温度可以显著降低酸性电荷变异水平，且随着酸性电荷变体含量的减少，主峰的含量有所增加。
图1：Effects of different shift temperatures on cell growth，mAb titer，and acidic charge variant content；（A）Viable cell density（VcD）；（B）mAb titer；（C）Content of acidic charge variants on day 14； All data points in panels A to C correspond to the averages of biological triplicates±standard deviation；*P<0.05（two-tailed Student's t-test）
为了研究降温时间对CHO细胞生长、单抗滴度和酸性电荷变体含量的影响，继续在1 L反应器中以初始温度37 ℃和初始密度2.0×105 cells/mL进行培养。
其中，对照组恒温37 ℃培养，实验组分别在第3天和第5天降温到33 ℃至培养结束。重点研究酸性电荷变体含量随不同降温时间的变化（图2C）。第14天，对照组的酸性电荷变体含量为40%。相比之下，在第3天和第5天降温到33 ℃的实验组酸性变体含量分别为20%和22%。虽然将降温时间从第5天提前到第3天并没有进一步改善酸性电荷变体含量，但在两个实验组中酸性电荷变体含量都明显低于对照组。
图2：Effects of changes in the timing of temperature shift on cell growth，mAb titer，and acidic charge variant content；（A）Viable cell density（VCD）；（B）mAb titer；（C）Content of acidic charge variants on day 14；All data points in panels A to C correspond to the averages of biological triplicates±standard deviation；*P<005（two-tailed Student's t-test）
除了工艺参数的优化之外，在之前的微信推文《改善蛋白电荷异质性新策略》中也介绍了通过优化培养基组分改善蛋白电荷异质性，以及HyClone原型培养基PSL A01/PSL A02搭配不同比例CB7a/b对酸峰的改善作用。
总之，通过筛选不同的的商业化培养基去改善酸性电荷变体含量相对简单，但如果是做针对性的培养基组分优化则需要对电荷异质性的原因有深入的了解并且会更耗时费力。
针对这种情况以及当前三抗/四抗/融合蛋白等复杂分子类型生产过程中出现的细胞密度/活率维持不佳、产量和关键质量无法满足要求的情况，Cyitva于今年3月在上海正式启动的细胞培养基开发基地依托全球庞大的培养基原型库、统一的质量标准和生产工艺，为充满“疑难杂症”的复杂项目量身定制稳定优质的培养基。
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Cytiva中国细胞培养基开发基地落地上海，赋能本土研发！
改善蛋白电荷异质性新策略
参考文献：
1.Kishishita,Shohei,Nishikawa,et al.Effect of temperature shift on levels of acidic charge variants in IgG monoclonal antibodies in Chinese hamster ovary cell culture[J].
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