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液滴微流控技术使人们能够满足日益增长的筛选大型生物样本库的需求。吸光度光谱通过无标签目标识别补充了荧光检测的黄金标准，并提供了更多的可量化数据。然而，这受到速度和灵敏度的限制。在本文中，我们通过加入声流体来提高分选速度，实现了1 kHz的目标液滴分选率。我们改进了微流控PDMS光聚焦准直装置的吸光度检测装置设计，利用集成透镜对样品进行基于纤维的问询。这种光学改进减少了散射和折射伪影，提高了信号质量和灵敏度。这种新颖的设计使我们能够克服基于介电分选的限制，例如液滴大小依赖性，样品的材料和介电性质。我们的声波激活吸收分选机消除了对偏移染料或匹配油的需求，并且比当前的吸收分选机更快地进行分类。

液滴微流体的一个强大方面是能够快速筛选，并在高通量下从大量的小体积液滴（pL）中进行分类。这是生物化学和分子生物学中许多需要敏感筛选的应用所必需的。吞吐量是筛选和鉴定超大型文库以及选择具有所需特性的靶细胞的关键。

液滴可以通过微流体偏转主动分选到使用电、声、磁、气动或热控制的收集通道中。Baret等人采用介电泳液滴分选，分选率可达数kHz。然而，这种分选技术取决于液滴体积和液滴的介电对比，以及施加高达几千伏电压的连续流体。据报道，这样的电场强度可能对细胞和电穿孔造成潜在伤害或丧失生存能力。

我们使用声波分选，因为需要压电基板上的低电场，因此不会对细胞造成伤害。声学液滴分选，已经显示出以千赫的液滴速率对液滴和颗粒进行分选。利用声波对液滴进行分类可以通过不同的波类型来实现，例如表面声波和体声波。表面声波（SAW）在通道内产生声波流，改变流动，从而使液滴偏转。因此，声学分选与液滴的含量、性质或体积无关，并且使用较低的应用功率来实现分选。

在液滴流体中分选通常由液滴含量的荧光信号触发，例如荧光细胞或测定。它是酶活性检测和荧光活化液滴分选（FADS）的有力工具，利用激光激发液滴的荧光。需要在液滴内存在荧光团标签以产生荧光读数，从而将人工制品引入系统。荧光分选装置通常需要昂贵和复杂的光学装置。

相比之下，吸光度检测具有更小，更简单的设置以及不需要荧光标签的潜力。吸收光谱法广泛用于比色分析、蛋白质定量和酶动力学的读出，因此补充了荧光技术。标准样品在比色皿中测量，样品体积通常为0.2-4 mL，路径长度为1厘米。最近，纳米滴光谱已经发展到使用约1 μL的样品体积。然而，所有这些方法的样品测量率都很低，每个样品需要几分钟的时间来测量。

液滴微流体提供了将吸收光谱的功率与以皮升为单位的样品体积和kHz范围内的样品吞吐量相结合的可能性。

液滴吸光度检测面临的一个挑战是液滴体积小，光程长度短（μm），这会影响检测的灵敏度。利用集成光纤可以检测吸光度。电压信号与比尔-朗伯定律相关，液滴溶液的吸光度可以计算出来。

光纤很容易集成到微流控芯片中，它们成本低且灵活，可以简化分选实验的总体设置，并已用于微流控芯片中的荧光和吸光度检测。

Gielen等人介绍了一种吸收度激活液滴分选器（AADS），利用电泳术和光纤对吸光度读数后的液滴进行分选，分选率为300 Hz。他们声称，由于油相和水相的不同折射率导致液滴中的信号伪像，因此无法对浓度低于100 μM WST-1的甲醛进行分选。在他们的定向进化实验中，在分析中加入1 mM WST1-formazan来掩盖信号中的伪迹。最近，Probst等人和Duncombe等人18证明了全紫外-可见光谱筛选和分选，由于全光谱筛选降低了通量，因此液滴率低于100 Hz。Duncombe等人将路径长度从50 μm增加到300 μm，液滴体积超过300 pL。

在上面引用的三篇论文中，已经证明了微流控液滴分选对各种系统的重要性。这些包括NAD+依赖性氨基酸脱氢酶的定向进化试验，单克隆微菌落麦角硫酶活性的测量以及监测盐诱导金聚集的监测。

在这里，我们结合了基于表面声波（SAW）分选的快速筛选能力和吸光度检测的优势。这使得吸光度触发的分选率比Gielen等人报道的要高一个数量级。

研究表明，微透镜和微镜等光流元件可以以气穴的形式集成到PDMS的微流控芯片中。为了提高灵敏度，在PDMS中使用了光学空腔形式的微透镜来准直光纤发出的发散光，从而改善了信号。

将光纤吸光度检测与声学液滴分类相结合，使我们能够以高达kHz的液滴率进行分类。我们可以在浓度低于100 μM的酒石黄中不添加偏移染料而对液滴进行分选，并通过光学方法克服了与信号质量和人工制品相关的问题。通过机械密封PDMS通道到基板，我们可以重复使用我们的数字间换能器（IDT）。

液滴产生

采用注射泵和利用流动聚焦结构（420 μL/h油相，65 μL/h水相）的液滴芯片产生直径为70 μm的液滴微球，并将其收集在制备好的收集器移液管尖端上。

采用HFE Novec 7500 （3M，USA）含1.8% FluoSurf表面活性剂（Emulseo，France）的氟化油为连续相，水溶液为分散相形成液滴。表面活性剂用于稳定液滴界面，防止液滴在重新注入芯片时破裂或合并。为了分析检测能力，使用了美国Sigma Aldrich公司的tartrazine dilutions，并使用0.03和1 mM的tartrazine混合种群进行偏转表征实验。在显微镜视频中，溴酚蓝色液滴明显比水的更暗，从而可以明显地确认分选效率。

图1：声激活吸光型液滴分选器（AcAADS）可分为五个功能区：液滴间距、吸光检测、液滴聚焦到优先流、液滴被SAW偏转和分选到两个废物出口通道。箭头表示流动方向，液滴的颜色表示液滴含量的不同吸光度值。

图2：液滴吸光度信号分析及灵敏度测定。7个30 μM酒石黄液滴通过acaads芯片检测器的信号。将油的信号基线设置为LED的8v。单个液滴信号剖面的两个向下的峰分别代表液滴在检测区域的入口和出口。B采用改进设计的集成双凹微透镜对12个30 μM酒石黄液滴的信号。单次下降的信号完全低于基线，中央峰值已经减弱，成为剖面中的一个小肩。C 1500个液滴的平均吸光度值和最小吸光度值的平均值与酒石黄浓度对应。以水滴信号为参考，根据实测液滴电压信号，利用比尔-朗伯定律计算吸光度A。单个液滴的液滴平均值由每5 μs取一次的电压信号之和除以峰值持续时间确定。酒石黄浓度吸光度数据的线性回归函数为f(x) = mx + b，其中mmean = 3.29 × 10?5±1.048 × 10?6,bmean = 5.21 × 10?5,mmin = 6.08 × 10?5±4.48 × 10?6,bmin = - 5.32 × 10?4。

图3：芯片检测区域示意图，双凹微透镜设计及准直光束（蓝色）。由于探测光纤的芯径较大，两个透镜的焦距不同。

图4：水和溴酚蓝水滴轨迹帧叠加，其中水滴信号电压设置分选值。暗溴酚蓝色液滴没有被分类，流入废物通道。使用两个聚焦入口调节流量。当检测到水滴时，在设定的延迟时间后触发SAW，水滴偏转到上通道。

图5：声流对液滴偏转的表征。当SAW持续开启时，液滴在不同施加功率下的轨迹图。这是用来建立SAW的有效区域和最佳液滴位置，相对于IDT的偏转。同时，SAW的最佳导通时间。为了获得最佳的偏转，液滴应该在斜率变为正的轨迹点上。液滴偏转距离较短，约为100 μm。B描述液滴轨迹（灰色箭头）和鞘层流动（绿色箭头）的示意图。当声学关闭时，护套流被用来集中液滴流出废物通道。我们通过在上聚焦入口的入口施加更高的压力来实现这一点，并产生更快的流动，如较大的绿色箭头所示，与低聚焦入口相比。hSAW和hour的挠度距离测量位置定义为SAW驱动点和两个出口通道分离尖端的挠度。

图6：在脉冲长度为50 μs ~ 1 ms、脉冲速率为300、800、1300 Hz时，在251 mW条件下，70 μm液滴的偏转曲线图。A液滴偏转在SAW活跃区域hSAW和B在出口通道开始时h。C在功率为251 mW、脉冲长度为50 μs ~ 1 ms、液滴速率为1300、800和300 Hz时的分选效率。

图7：30 μM和80 μM酒黄石液滴在1 kHz分选速率下的检测和分选过程示意图。上面的显微照片是分选过程的时空表现（重片图像）。图像是根据从液滴排序视频中逐帧以固定线拍摄的像素计算的，然后根据时间绘制。我们在显微镜图（右图）中以橙色突出显示的两个出口上定位重切片线。因此，薄片显微图中上部通道为含有6个偏转液滴的分选通道，下部通道为含有24个未偏转液滴的废通道。原始液滴吸光度信号数据显示在中心图（蓝色曲线）中。使用LabVIEW软件实时分析，生成每个液滴的最小峰值和平均峰值。当最小峰值超过阈值（红色）时，产生排序触发信号（底部灰色图）。触发信号被触发（灰色），预设延时tdelay = 1.12 ms，如黑色箭头所示，表示水滴从检测区流向分拣区所需的时间。单个目标液滴（80 μM酒黄石）在检测、触发和切片图像中被编号标记，以便进行比较。该图涵盖了从1秒的排序过程中提取的30毫秒的提取。

本文提出了一种声激活吸收型液滴分选器，该分选器采用集成双凹透镜对光束进行聚焦。我们减少了先前报道的散射效应，提高了灵敏度。得到的液滴信号形状使我们能够对浓度差为50 μM的液滴进行分类，当浓度差较小时，峰值散点图中的簇重叠。此外，我们可以在1 kHz的液滴速率下对直径为70 μm的液滴进行分选，比之前报道的300 Hz更快。对粒径为30 μM和80 μM的两种液滴种群进行了分选实验。为了进一步提高液滴速率，需要调整通道设计以匹配液滴大小，并减少最终导致液滴解体和形成子液滴的液滴变形。对于更高的分选率，可能需要应用更高的声呐功率才能成功分选，因为较长的声脉冲长度可能会影响邻近的液滴。光流元件的分离，全部集成到PDMS模具中，压电芯片是纯机械接触，允许我们重复使用芯片，并在一个芯片上操作多个不同的通道。Medcalf等人使用折射率匹配和改进的微通道来提高吸光度信号质量和介电泳液滴分选的吞吐量。结合这两种技术有可能进一步改进基于吸光度的液滴分选。

参考文献：

Richter ES, Link A, McGrath JS, Sparrow RW, Gantz M, Medcalf EJ, Hollfelder F, Franke T. Acoustic sorting of microfluidic droplets at kHz rates using optical absorbance. Lab Chip. 2022 Dec 20;23(1):195-202. doi: 10.1039/d2lc00871h. 

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