PCR原理、PCR扩增影响因素及预防解决方案

PCR简介

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析的一种反应。

PCR扩增原理

核酸降解是DNA/RNA分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键，或磷酸二酯键在物理因素、化学因素和生物因素等作用下发生水解，使DNA/RNA链发生断裂。

▲ 图一：PCR原理反应示意图

▲ 图二：PCR反应过程中温度变化图

实时荧光定量PCR原理

通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合相应软件可以对结果进行分析，通过标准曲线对未知模板进行定量分析，计算待测样本的初始模板浓度。

▶  初始DNA浓度越高，荧光达到某一值（阈值）时所需要的循环数越少（Cq值）。

▶  Log浓度与循环数成线性关系，根据样品扩增到阈值的循环数与已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线对比就可以计算出该样品的起始拷贝数。

影响PCR扩增的因素

▶  模板间的交叉污染。

▶  PCR试剂的污染。

▶  PCR产物的污染。

防止污染的预防操作

❶ 永远要设置NTC（No Template Control）对照，一个不含有模板DNA但含有PCR体系中所有其他成分的对照。如果不能发现，会导致后续一系列的数据无法使用。

❷ 准备PCR体系的移液器要专用，千万不能用吸取过PCR产物的移液器去准备PCR体系。

❸ 打开离心管前先离心，开管动作要轻，以防管内液体溅出。

❹ 在加完其他反应成分再加入模板。

❺ 实验结束后及时清理台面。

出现污染后的解决办法

❶ 更换试剂：更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用。

❷ 清洁所有可能的污染源：实验台面，离心机，门把手等。

❸ 实验过程更加小心，采用前面提到的各种防止污染的方法。

Cielo实时荧光定量PCR系统

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