经典磁珠一文解读：是什么导致你的NGS片筛大小偏离

基于SPRI固相可逆固定化技术的AMPure XP及SPRIselect NGS文库纯化(clean up)和片筛(Size selection)试剂家喻户晓。SPRI技术采用顺磁磁珠选择性结合特定大小核酸片段，被引频次超过20000+，同时被超过200+测序建库试剂盒使用。要知道测序文库片段大小直接影响数据的有效性。SPRIselect作为针对精 准片筛专门优化的试剂盒，具备高重复性和室温稳定性（室温保存无需冷藏）。

* SPRIselect在8次实验0.85X左侧和右侧筛选中表现出高重复性

0.85X Left Side Size Selection                              0.85X Right Side Size Selection

* 不同批次SPRIselect的片筛结果片段平均长度Std Dev<8.18%

纵然有SPRIselect这样可靠、高效的金标准磁珠，为什么我会遇到片段大小不符合预期的情况？为什么按照文献说的比例添加磁珠，纯化的片段没有除掉小片段？

问题究竟出在哪里？

小贝带你一探究竟！

我们从原理开始

SPRI技术的魔法不只是磁珠而已，试剂盒溶液的各个组分也倾情参与。SPRI磁珠在磁珠和溶液有效组分的双重作用下，优先结合更长片段。当提高SPRIselect试剂的投入量，磁球增多的同时试剂组分浓度也增 高，越有利于更小的片段与磁珠结合。这也是SPRIselect能够通过调整加入试剂的比例，实现不同长短核酸片段筛选的原因所在。

在优化条件下，待处理样品溶解在分子生物学级水或标准缓冲溶液（如Tris或TE）中，但实验中我们往往也会碰到更复杂的反应基质。接下来我们将一些实验室常用试剂添加到SPRIselect片筛反应中，观察这些添加组分是否会影响片筛尺寸效果。

实验设计

以左侧筛选实验进行测试，每个实验均为50μL 1μg片段化的双链DNA+50μL添加试剂+65μL SPRIselect（0.65x）。采用100μL水进行洗脱，安捷伦高灵敏度DNA芯片检测1μL产物。红色峰线为0.65X无额外添加试剂的片筛对照。

实验结果

DMSO (Dimethyl sulfoxide)

0,0.00005X,0.0005X,0.005X,0.05X,0.1X,0.3X

影响：None

DTT (Dithiothreitol)

0mM,0.05mM,0.5mM,5mM,25mM,250mM

影响：None

85% 乙醇

0%,1%,9%,18%,30%

影响：片段筛选展宽

甘油

0%,0.001%,0.01%,0.1%,1%,10%

影响：片段筛选收窄

KCI (Potassium chloride)

0mM,0.05mM,0.5mM,5mM,50mM,250mM

影响：None

MgCl2 (Magnesium chloride)

0mM,0.1mM,1mM,10mM,25mM,50mM,100mM, 500mM

影响：片段筛选展宽

NaCl (Sodium chloride)

0mM,10mM,293mM,576mM,1000mM

影响：None

PEG (Polyethylene glycol)

0%,1%,5%,9%,15%

影响：片段筛选展宽

pH=2-10

影响：pH<3时片段筛选变窄，pH≥3无影响。

Sodium Acetate

0mM,0.1mM,5mM,10mM,50mM,300mM,900mM

影响：None

实验结语

1、添加剂组分的加成效应是累积的。如果有多个添加剂都朝同一方向移动片段大小，则结果将大于任何单一组分的作用。如果某些组分将片筛向左移动，而某些组分向右移动，则可能几乎不产生偏移效果。

2、在遵照建库试剂盒说明书使用比例的情况下，可参考以上实验组分的影响帮助您开展trouble shooting。