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考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白含量
1、实验目的:掌握考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白含量的原理和方法。2、实验内容实验原理:考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的Zda吸收峰的位置(λmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别色精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测得的吸光度A595nm,与蛋白质浓度成正比。试剂与材料:1.标准蛋白质溶液称取牛血清白蛋白(BSA)10mg,溶于100ml水,配置成100μg/ml的标准蛋白质溶液。2.考马斯亮蓝G-250染料试剂100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%的乙醇后,再加入120ml85%的磷酸,用水稀释至1L。3.材料:豆芽操作步骤:1标准曲线的绘制取试管6支按下表操作,摇匀,2~5min后比色(595nm),1管为空白对照管。作吸光度-蛋白浓度曲线。管号1234561.0mg/ml标准蛋白质(ml)00.200.400.600.200蒸馏水(ml)1.000.800.600.400.801.00考马斯亮蓝G-250染料(ml)52样品蛋白浓度测定准确称取豆芽1.0000g,加入用10mL研磨成匀浆后,5000转/分钟离心10分钟,将上清液转入小烧杯中。准确吸取样品上清液1ml置干净试管中,加入考马斯亮蓝G-250染料5ml并摇匀,2~5min后比色(595nm)。对照标准曲线求出样品蛋白浓度。
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