乳、乳制品及饲料中三聚氰胺的检测

乳、乳制品及饲料中三聚氰胺的测定
一．名词简介
1.  三聚氰胺理化性质
三聚氰胺：英文名“melamine”，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3；分子量：126.12；物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；相对密度：1570kg/m³；熔点：在常压下，354℃分解；升华温度：300℃；溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性。
化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。
2.  乳制品
是指以生鲜牛（羊）乳及其制品为主要原料，经加工而制成的各种食品。本标准所指的乳制品包括液体乳类（杀菌乳、灭菌乳、酸牛乳、配方乳）、乳粉类（全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂加糖乳粉和调味乳粉、婴幼儿乳粉、其他配方乳粉）、含乳饮料类、炼乳类（全脂无糖炼乳、全脂加糖炼乳、调味炼乳；配方炼乳）、乳脂肪类（稀奶油、奶油、无水奶油）、干酪类（原干酪；再制干酪）、乳冰淇淋类（乳冰淇淋、乳冰）和其他乳制品类（干酪素、乳糖、乳清粉、浓缩乳清蛋白）等。

二．GX液相色谱法测定
1.  原理
  试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液，经GX液相色谱测定，根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。
2  试剂
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为GB/T 6682-2008中一级用水，溶液为水溶液。
2.1  磺基水杨酸。
2.2  柠檬酸。 
2.3  辛烷磺酸钠：GX液相色谱离子对试剂。 
2.4  乙腈：色谱纯。
2.5  盐酸。 
2.6  60 g/L磺基水杨酸：称取60 g磺基水杨酸用水定容至1 L。
2.7  0.1 mol/L盐酸：量取8.3 mL盐酸用水稀释至1 L。
2.8  缓冲液：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为10 mmol/L。
2.9  三聚氰胺标准品：已知含量大于99%。
2.10 标准储备液：称取三聚氰胺标准品0.01g（准确至0.0 001g），用甲醇配制成浓度为1mg/mL标准储备液。
2.11 标准系列：将标准储备液用0.1 mol/L盐酸逐级稀释至0.25µg/mL，0.50µg/mL，1.00 µg/mL，2.00 µg/mL，4.00 µg/mL，5.00 µg/mL，10.0 µg/mL的系列标准溶液。
3  仪器成套性
3.1  GX液相色谱仪
3.1.1  P3000型 高压输液泵
3.1.2  UV3000紫外检测器
3.1.3  Rehodyne手动进样阀(20μl)
3.1.4  CXTH3000色谱工作软件
3.1.5  ODS（VenusilASB-C18色谱柱）  250 mm×4.6 mm，5 µm
3.1.6  分析启动工具包
3.1.7  溶剂托盘
3.1.8  试剂包
3.1.9  保护柱和柱芯
3.1.10真空固相萃取装置（含混合型的阳离子交换柱10根）
3.2  溶剂过滤器（含真空泵）
3.3  超声波清洗器
3.4  柱温箱
3.5  高速离心机：转速》4 000 r/min
3.6  旋涡混匀器
3.7  分析天平：感量0.1mg
4  样品处理
4.1  固态乳制品
称取1.0 g左右试样（准确至0.0 001 g），加入0.1 mol/L 盐酸约15 mL，涡旋混匀，超声提取30 min后加入60 g/L磺基水杨酸6 mL ~8 mL，用0.1 mol/L 盐酸定容至25 mL，混匀后离心，上清液经0.45 µm的微孔滤膜过滤后进样。
4.2  液态乳制品（包含酸奶）
称取15 g左右试样（准确至0.0 001 g），加入60 g/L磺基水杨酸3 mL~4 mL，用0.1 mol/L 盐酸定容至25 mL，混匀后离心，上清液经0.45 µm的微孔滤膜过滤后进样。
4.3  饲料
称取1.0g左右试样（准确至0.0 001 g），将样品用研钵充分碾碎混匀，加入0.1 mol/L 盐酸约15 mL，涡旋混匀，超声提取30 min后加入60 g/L磺基水杨酸6 mL ~8 mL，用0.1 mol/L 盐酸定容至25 mL，混匀后离心，上清液经0.45 µm的微孔滤膜过滤后进样。
5  测定步骤
5.1  色谱条件
5.1.1  色谱柱：ODS或C8，250 mm×4.6 mm，5 µm。
5.1.2  流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15。
5.1.3  流速：1.0 mL/min。
5.1.4  柱温：40 ℃。
5.1.5  波长：240 nm。
上述色谱条件是典型的，可根据实际情况做具体调整。如果分离效果不理想，将水相改为：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为10 mmol/L，加3mL三，配制成1000mL溶液，流动相用氨水调PH值3.9到3.95。
5.2测定
5.2.1  标准曲线制备
将标准系列0.25µg/mL，0.50µg/mL，1.00 µg/mL，2.00 µg/mL，4.00 µg/mL，5.00 µg/mL，10.0 µg/mL分别进样20 µL,以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，制作标准曲线。
5.2.2  样品测定
取制备好的试样溶液进样20 µL,进行液相色谱分析。根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。三聚氰胺的标准样品色谱图见图1，液态奶样品色谱图见图2，奶粉样品色谱图见图3。





图1  标样色谱图






仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000 
色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm  
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三调PH3.9 
流速：1.0 mL/min
柱温：40 ℃ 
波长：240 nm 





图2  液态奶样品色谱图






仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000 
色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm  
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三调PH3.9 
流速：1.0 mL/min 
柱温：40 ℃ 
波长：240 nm 





图3 奶粉样品色谱图  





仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000 
色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm  
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三调PH3.9 
流速：1.0 mL/min 
柱温：40 ℃ 
波长：240 nm 
6  结果计算
6.1  计算
试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）按式（1）计算:

 C×V
  X = ————………………………………………………（1）
m
式中：X—样品中三聚氰胺含量，mg/kg；
C—从标准曲线上查出的含量，µg/mL；
V—定容体积，mL；
m—称样量，g。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

本文参考以下方法：
HPLC-UV检测方法 
三聚氰胺在传统的C18柱上保留很<