紫外分光光度法测定蛋白质含量

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【导读】一、实验原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其...

一、实验原理

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是民迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）得到广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。根据蛋白质和核酸的吸收高峰不同，并利用这一性质，通过计算可以适当校正核酸的干扰作用。

二、实验用品

(一)器材

(1)752紫外分光光度计。

(2)移液管。

(3)试管及试管架。

（二）试剂

标准蛋白质溶液：准确称量经微量凯氏定氮法校正标准蛋白质，用重蒸馏水配制成浓度为1mg/ml的溶液。

(三)材料

待测蛋白质样品溶液（用重蒸馏水适当稀释）。

三、实验程序

1.标准法制作标准曲线

取8支试管，按表1-1分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。

选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm处分别测定各管溶液的OD280值。以蛋白质浓度为横坐标，OD280值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.样品测定

取适当浓度的待测蛋白质溶液，同样选用光程为1cm的石英比色杯，测定280nm处的光吸收值，并从标准曲线上查出待测定蛋白质的浓度。

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2004-08-27 09:23:05

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