考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量

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【导读】一、实验原理考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）测定蛋白含量存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变蓝色形式，最大光吸收由4...

一、实验原理

考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）测定蛋白含量存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变蓝色形式，Zda光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’slaw），因此可以通过测定染料在595nm处吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。本法测定范围为10~100g蛋白质。

由于该法简单、迅速、干扰物质少、重复性好、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。

二、实验用品

(一)器材

(1)722分光光度计。

(2)微量进样器。

(3)移液管（0.1ml及5ml）。

(4)试管及试管架。

(二)、试剂

(1)标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6测定蛋白质含量，再用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml蛋白质溶液。

(2)考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。Z终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。

(三)材料

末知蛋白质溶液，要求蛋白质浓度范围为0.1~5mg/ml，若浓度过度时，需用0.15mol/LNaCl溶液适当稀释。

三、实验程序

（一）操作方法

1.标准法制作标准曲线

取14支试管，分两组按表1-1平行操作。

以OD595为纵坐标,标准蛋白为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

2.微量法制作标准曲线

取12支试管，分两组按表1-2平行操作。

3.末知样品蛋白质浓度的测定

测定方法同上，取合适的末知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出末知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。

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2004-08-27 09:23:05

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