GB 31658.2-2021前处理关键点和要点 动物性食品中氯霉素残留量的测定 液相色谱－串联质谱法

原理

试料中残留的氯霉素，采用间位氯霉素或氘代氯霉素作内标，依次用乙腈、4%氯化钠去蛋白，正己烷脱脂，乙酸乙酯提取，固相萃取柱净化，氮气吹干，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。

8.1 提取 取试料5 g（准确至±0.02 g），加内标工作液250 µL、乙腈5 mL、 4 %氯化钠溶液5 mL，涡旋振荡2 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，残渣重复提取1 次，合并上清液。加正己烷5 mL，涡旋振荡1 min，2 000 r/min离心10 min，弃去上层液，正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL，涡旋振荡1 min，2 000 r/min离心10 min，上层液转移到15 mL离心管中，重复提取1次，合并提取液，氮气吹干，加水-乙腈（95:5）3 mL使溶解，备用。

关键词：动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除

要点：

• GB 31658.2是采用4%的氯化钠溶液对样品中的蛋白质进行沉淀，同时也加入了乙腈进一步沉淀样品组织中的蛋白质。然后，用正己烷进行萃取，去除动物组织中脂肪和杂质。接下来乙酸乙酯反萃取。

关键词：氮气吹干

要点：

• 提取后，注意氮气要吹干，如果没有吹干，样品中含有乙酸乙酯对后面的进行小柱净化有影响，从而影响回收率。

关键词：加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取

要点：

• 由于洗脱液是用甲醇和水（1：1）4 mL，体积比较大，含水也比较高，不易挥发和浓缩。

• 加水饱和乙酸乙酯溶液进行反萃，实际上是进行了一个溶剂转换。

• 转换的目的，一方面是乙酸乙酯溶液比较容易吹干，另一方面也增加了一次萃取和净化，使得样品更加干净，进一步去除杂质。

8.2 净化 取固相萃取柱，依次用甲醇、水各10 mL预洗。备用液过柱，加水洗柱2次，每次3 mL， 加流动相4 mL，以1 mL/min速度洗脱，收集洗脱液。加水饱和乙酸乙酯溶液4 mL，涡旋振 荡1 min，2000 r/min离心5分钟，取上层液，重复处理1次，合并上层溶液，氮气吹干。加流动相1.0 mL使溶解，滤过，供液相色谱-串联质谱测定。

关键词：预洗

要点：

• 在净化过程中，C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL预洗，标准中净化柱使用的是传统的C18小柱 200 mg/6 mL (PN：AN60B004，纳鸥科技），是一个很早就商品化的小柱，净化之前，C18小柱需要提前预洗，不能直接对干的小柱进行活化，不然会影响到回收率。

• 这个与后续商品化的HLB-P小柱不同，HLB-P小柱省去传统的活化、平衡步骤，样品经提取后直接过柱。

关键词：多步骤的萃取和反萃取

要点：

• 氯霉素提取和净化过程中经过了多步骤的萃取和反萃取。

• 具体步骤：乙腈+4 %氯化钠溶液提取→正己烷脱脂→加水饱和乙酸乙酯反萃→水-乙腈（95:5）复溶解→流动相洗脱→水饱和乙酸乙酯→流动相溶解→上机。

• 在GB 31658.2这是一个很经典的提取体系，这么多次的萃取，实际上是利用了氯霉素在不同的溶剂体系中溶解度差异，从而来完成样液的净化和溶剂转换。整个过程包括了，萃取、反萃取、固相萃取柱净化，是一个很典型的样品净化和富集案例。

• 经过以上复杂的前处理操作流程，操作手法不太熟练，以及某些关键点没有注意到，很容易导致回收率受到影响。