高效薄层色谱法鉴别6种中药多糖

　　多糖是一类由单糖(通常大于10个)通过糖苷键连接而成的生物大分子聚合物，是生物体维持生命活动的必需物质。近年来，由传统中药及天然药物中分离得到的多糖类成分，因其广泛的生物活性，如抗肿瘤，调节免疫，抗病毒等[1-4]已成为多糖研究的热点。然而，如何鉴别不同来源的中药多糖一直是个难题，也是多糖质量控制的关键问题。目前多种现代仪器分析方法，如薄层色谱[5]、气相色谱[6]、高效液相色谱[7]、质谱[8]、核磁共振[9]等已应用于多糖的结构分析中，其中薄层色谱因其简单、快速、样本量大、成本低等优点已成为单糖、寡糖成分鉴别的常用方法[5]。本文应用高效薄层色谱(HPTLC)法对6种常用中药多糖的酸水解产物进行分析，以7种单糖和2种糖醛酸为对照，采用2种不同的显色剂对组成糖类成分及结合氨基酸类成分分别显色，获得了可用于鉴别的特征薄层色谱。

　　1 仪器与试药

　　Desga 高效薄层系统(含AS30自动点样器，CD60扫描仪，Pro Quant扫描软件 德国Desga公司);双槽展开缸;高效硅胶60板(德国MACHEREY-NAGEL 公司)。微波提取仪 (Multiwave3000, Antonpaar, 奥地利)

　　D-半乳糖，D-葡萄糖，D-核糖，D-木糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖，L-鼠李糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖醛酸(美国Sigma公司); 水(MilliQ 纯水);其他试剂均为分析纯。人参(Panax ginseng)，西洋参(Panax quinquefolii)，三七(Panax notoginseng)，冬虫夏草(Cordyceps sinesis)购于澳门中侨参茸公司，黄芪(Astragalus memberanaceus)采自山西，灵芝(Ganoderma lucidum)采自安徽金寨，均由通讯作者鉴定。 2 方法

　　2.1 对照品溶液的制备

　　取D-葡萄糖0.5 mg，D-核糖1.5 mg，D-木糖1.5 mg，D-甘露糖0.5 mg，L-阿拉伯糖1.0 mg，L-鼠李糖0.5 mg，D-半乳糖醛酸1.0 mg，D-葡萄糖醛酸1.0 mg，精确称定，溶于1 mL 95%乙醇制成混合对照品溶液。 2.2 供试品溶液的制备

　　取干燥药材粉末1 g，加入10 mL水，置微波提取仪中于120 ◦C 下提取15 min，提取液于4500 rpm下离心10 min后取上清液，加入40 mL 95%乙醇后于4 ◦C冰箱内醇沉过夜。混悬液再次离心，弃去上清液，沉淀以5 mL 95%乙醇洗涤2次后冷冻干燥得粗多糖。取粗多糖10 mg溶于5 mL三氟醋酸(TFA)，置于氮气保护密封试管内100 ◦C水解2 h。水解液低压旋干，残渣溶于1 mL 50%乙醇得供试品溶液。 2.3展开剂和显色剂

　　以正丁醇：甲醇：氯仿：冰醋酸：水=12.5:4.5:5:1.5:1.5(v/v) 展开，苯胺-二苯胺溶液(二苯胺4 g、苯胺4 mL、85%磷酸20mL混合溶解于200 mL丙酮溶液中)和茚三酮溶液(0.2 g茚三酮溶解于100 mL 丙酮中)为显色剂。 2.4 薄层层析

　　高效薄层板(20 cm×10 cm)，点样量10 μL，混合对照品点样1 μL，样品条带宽10 mm，间隔15 mm，起始点样高度10 mm。点样后薄层板放入已预先饱和30 min的双槽层析缸中展开，展开距离9 cm，取出吹干，喷显色剂苯胺-二苯胺显色后，130 ◦C加热显色至斑点清晰;或喷茚三酮后，105◦C加热显色至斑点清晰，覆盖同样大小玻璃板，四周用胶布封固后作薄层扫描。 3 结果

　　3.1多糖水解条件的优化 3.1.1酸的选择

　　参考文献[10]的方法，以人参多糖为样品分别使用硫酸、盐酸和三氟醋酸进行完全酸水解考察。硫酸水解：10 mg样品加入5mL 1 mol•L-1硫酸，密封试管100 ◦C下水解4 h，水解液冷却后加入足量碳酸钡中和，4500 rpm下离心10min后收集上清液，沉淀以5 mL 50%乙醇洗涤后再离心，合并上清液。上清液于40 ◦C下低压蒸干，残渣溶于1 mL 50%乙醇备用。盐酸水解：10mg样品加入5 mL 2 mol•L-1盐酸，100 ◦C水解4 h，水解液冷却后加入NaOH溶液中和，溶液于40 ◦C下低压蒸干，残渣溶于1mL 50%乙醇备用。三氟醋酸水解：水解方法同2.2，水解时间为4 h。结果见图1，由图可见，盐酸水解后因中和步骤产生大量的NaCl，干扰了展开条带;硫酸水解产物可得清晰条带，但因中和步骤繁琐而导致产物损失;采用TFA水解，操作简单，条带多且清晰，产物损失较小，故选用TFA进行多糖水解。

　　图1 多糖水解用酸的选择

　　L1-TFA水解;L2-硫酸水解;L3-盐酸水解;L4-混合对照品;1，D-半乳糖醛酸;2，D-葡萄糖醛酸;3，D-半乳糖;4，D-葡萄糖;5，D-甘露糖;6，D-阿拉伯糖;7，D-木糖;8，D-核糖;9，L-鼠李糖

　　3.1.2 酸浓度的优化

　　以3.1.1中TFA水解的条件，分别使用2、1.5、1 mol•L-1 TFA进行水解，考察不同浓度TFA对多糖水解的影响。结果如图2，由图可见，随酸浓度降低，水解不完全，释放出的半乳糖醛酸(条带1)减少，且条带3下方条带(可能是未水解寡糖)增多，干扰糖醛酸检测，因此酸浓度选用2 mol•L^-1。

　　图2三氟乙酸浓度的优化

　　L1-2 mol•L^-1;L2-1.5 mol•L^-1;L3-1 mol•L^-1;L4-混合对照品;1-9，同图1

　　3.1.3水解时间的优化

　　以3.1.2中确定的TFA水解条件，分别考察4 h、2 h、1 h等不同水解时间。结果如图3，由图可见，1 h时水解不完全，条带3下方可见明显未水解寡糖条带，干扰糖醛酸检测，2 h与4 h水解效果相近，因此选择水解2 h。

　　图3多糖酸水解时间的优化

　　L1-4 h;L2-2 h;L3-1 h;L4-混合对照品;1-9，同图1

　　3.1.4 重复性考察

　　以3.1.3中所确定的TFA水解条件，取3份人参多糖样品平行水解，考察重复性，结果如图4，表明本水解条件重复性良好。

　　图4水解重复性考察

　　L1-L3，3份平行水解样品;L4-混合对照品;1-9，同图1

　　3.2 多糖的薄层色谱鉴别 3.2.1组成糖类成分特征色谱

　　6种中药多糖经完全酸水解后，以苯胺-二苯胺试剂显色，可得组成糖类成分特征色谱，如图5。由图可见，6种多糖的主要组成单糖均有葡萄糖，半乳糖，甘露糖，其中黄芪多糖、人参多糖、西洋参多糖及三七多糖中还含有少量阿拉伯糖与鼠李糖，并伴有少量半乳糖醛酸。灵芝多糖中呈现一条特殊的黄绿色条带(图中箭头所示)，可与其他多糖区分。冬虫夏草多糖中没有检测到糖醛酸。综上，通过糖类成分特征图谱，冬虫夏草多糖及灵芝多糖可明显区别与其他四种植物多糖。

　　图5 6种中药多糖酸水解产物的苯胺-二苯胺显色薄层色谱图

　　L1，黄芪;L2，冬虫夏草;L3，灵芝;L4，西洋参;L5，人参;L6 三七;L7-混合对照品;1-9，同图1

　　3.2.2氨基酸类成分特征色谱

　　6种多糖经完全酸水解后，以茚三酮试剂显色，可得多糖中氨基酸类成分的特征色谱，如图6。

　　图6 6种中药多糖水解产物的茚三酮显色薄层色谱图 L1-L6，同图5;A-K，特征条带

　　另对灵芝中5个特征条带(A，B，K，D和J)做光谱扫描，发现该类显色成分在550 nm处有Z大吸收，故以550 nm为扫描波长，背景吸收较弱的700 nm为参比波长，对所有样品进行透射模式扫描，狭缝宽度为6.00 nm × 0.02 nm。结果如图7。

　　图7 6种中药多糖水解产物的茚三酮显色光谱扫描图(λ= 550 nm) L1-L6，同图5;A-K，图6中特征条带对应的色谱峰

　　由图可见，黄芪、灵芝、冬虫夏草多糖水解产物中含有较多可使茚三酮显色的物质，而人参、三七和西洋参多糖中则较少。冬虫夏草多糖(L2)可见H、I 两个特征的条带;而灵芝多糖(L3)亦含有一特征条带K;黄芪多糖(L1)则含有一特征条带C，另外黄芪中含有条带F而灵芝与虫草中几乎没有，且虫草和灵芝中有J带而黄芪则没有，由此可区分黄芪多糖。西洋参多糖(L4)有明显的D条带，而三七与人参中不含有;三七与人参多糖(L5与L6)的结果较为相似，但L5中的A条带的颜色明显深于L6。综上，通过氨基酸类成分特征图谱，6种中药多糖基本可以明确区分。