ELISA实验中给检测样本加样的步骤详解

本文由 上海恒远ELISA试剂盒供应商 整理汇编

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• ELISA实验中给检测样本加样的步骤详解

  ELISA实验中给检测样本加样的步骤详解：1.细胞上清：前处理必须是细胞离心去除，每孔直接加100μl即可。如果浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。2.脑脊液：前处理必须是细胞离心去除，每孔直接加100μl即可。如果浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。3.血清血浆：加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本,如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。①血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；②血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。③血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；④标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。⑤请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。4.组织匀浆液的样本：要制备过程中需要在缓冲液中加入蛋白酶YZ剂，防止蛋白成份被内源性蛋白酶降解，造成检测结果的值偏低。因组织匀浆液的样本蛋白种类多，含量丰富，实验参照血清血浆标本的处理方法进行，否则就会影响实验结果。具体是加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本，需稀释时，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。[详细]

  2018-11-16 10:02

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• 加A试剂盒实验步骤

  利用具有3’-5’外切酶活性的高保真DNa聚合酶，如Pfu等进行PCR扩增时，其PCR产物为不带A尾的平末端DNa片段，如想将该片段克隆到T载体上，需要先利用A-Tai领Enzyme在平末端片段后加上A尾后才能与T载体上3’末端的T碱基互补连接。本产品是在平末端DNa片段的3’末端添加一个A尾，使平末端的DNa片段进行TA克隆成为可能。本试剂盒提供了加A尾需要的所有成分，可以在30分钟完成整个过程。与平末端DNa片段克隆相比，TA克隆具有较高的克隆效率，可大大提高实验成功率。[详细]

  2018-09-04 10:00

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  全自动电位滴定仪是一种通过测量滴定过程中电池电动势变化来确定滴定终点的仪器，广泛应用于多个领域。以下以测定某酸性溶液的浓度为例，详细介绍其操作步骤。 [详细]

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  大鼠多巴胺ELISA检测试剂盒实验步骤[详细]

  2015-04-21 00:00

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• ELISA试剂盒检测样本的原理和步骤

  ELISA试剂盒检测样本的原理和步骤标本：细胞液、体液以及组织匀浆使用说明书产品编号：E01H0019本试剂盒仅供科研使用，不得用于临床及诊断使用！预期应用ELISA试剂盒定量检测人细胞液、体液以及组织匀浆中8羟基脱氧鸟苷的含量。自备物品1.酶标仪（尽量提前预热）2.微量加液器、吸头3.蒸馏水或去离子水以及滤纸样本的采集及保存一般的生物标本包括有：血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等一般为无菌操作，低温保存（-80℃、液氮）一．如果采集的实质器官则要求：1、器官实质不能太小2、以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的地方为佳3、同一病例装入同一容器，并做好标记4、应在0-8℃的低温储存和运输5、实质性器官的处理：5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨5.2、加入约500ul的PBS/生理盐水，充分混匀5.3、离心5000rmpx10min，去上清5.4、-20℃保存，作为待检标本（切勿反复冻融）二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式1、血液包括血浆和血清它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸盐和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmpx5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4℃静置半小时后，800-1000rmpx5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；2、胃液和唾液的采集方式一般现采现用，但是一般饭后半小时内不易采集，因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶，**的采集的时间时空腹采集；3、尿液的采集方式基本和唾液一样的，即现采现用，但是一般隔夜尿不采集；4、组织提取液如肺泡灌洗液等，采集后离心分离，800-1000rmpx5min，取上清，-20℃或4℃保存备用；三．粪便以及天然孔排泄物：采集后一般现用PBS/生理盐水溶解，充分混匀，800-1000rmpx5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；四．活检组织一般进行穿刺检测，Z常见的就是肝活检，像病毒性肝炎、脂肪肝、各种类型的肝硬化等进行活检简单方便、准确。三、表达产物的检测（一）真核表达产物1、细胞上清（分泌性蛋白）1.2、贴壁细胞或半贴壁，直接将细胞培养上清吸出，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；1.2、不贴壁细胞，将培养基和细胞转移至10ml离心管，500-800rmpx10min，吸取上清至另一10ml离心管中，10000rmpx10min，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；2、细胞裂解物（非分泌性蛋白）2.1、贴壁细胞或半贴壁，直接将细胞培养上清吸出，然后用001MPBS（pH7.4）将细胞吹下至10ml离心管，500-800rmpx10min，弃上清，沉淀转移至1.5ml离心管中，DDW重悬，置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；2.2、不贴壁细胞，将培养基和细胞转移至10ml离心管，500-800rmpx10min，弃上清，沉淀移至另一10ml离心管中，0.01MPBS（pH7.4）重悬，500-800rmpx10min，弃上清，沉淀移至1.5ml离心管中，DDW重悬，置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；（二）原核（大肠杆菌表达系统）表达产物1、表达上清（非融合性蛋白）直接将培养物和上清吸出，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；2、菌体裂解物（融合性蛋白）直接将培养物和上清吸出，10000rmpx10min，弃上清，沉淀用PBS洗一遍，500-800rmpx10min，弃上清，DDW重悬沉淀，冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；ELISA试剂盒注意事项1.试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存。实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。2．加样：加样时，要控制加样速度，避免**孔与Z后一孔之见的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性；一般加样时间控制在10分钟内，如果样本数量过多，可使用多道移液器。3.孵育：样品要在密闭的容器内进行孵育，严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。4.洗涤：洗涤过程中反应孔中的残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，同时要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响Z后的酶标仪读数。5.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。6.建议实验前预测样品含量如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。7.建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，SY几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。操作步骤1.取出试剂盒，于室温（20-25℃）放置15-30分钟。实验过程应在室温（20-25℃）内进行。2.取出酶标板，按照标准品的次序分别加入50μl的标准品溶液于空白微孔中。3.空白微孔中加入50μl的样品，空白对照加入50μl的蒸馏水；4.在样品孔中加入10μl的生物素；（不含空白对照孔,切忌：生物素只加样品孔！）5.在各孔中加入100μl的酶标记溶液；（不含空白对照孔）6.将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育反应1小时；（在孵育箱中保持稳定的温度与湿度）7.充分清洗酶标板3-5次，保持各孔有充足的水压；（浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释）8.酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干；9.各孔加入显色剂A、B液各50μl；（不含空白对照孔）10.20-25℃下避光反应15分钟；11.各孔加入50μl终止液，终止反应；ELISA试剂盒结果判断1.30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；2.以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；3.根据样品的OD值查找对应的浓度范围；4.敏感度：0.1ng/ml[详细]

  2018-09-14 10:01

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• ELISA法测定肺炎衣原体实验步骤

  ELISA法测定肺炎衣原体实验步骤[详细]

  2015-04-08 00:00

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• ELISA实验原理、步骤、问题分析

  上海恒远生物科技有限公司专业供应各种属elisa试剂盒，提供免费代测服务，保证实验结果客观真实性。我公司对试剂盒质量1**%保证，若存在质量问题，我们无条件包退换。若需要了解试剂盒的详细信息，请来的咨询：电话：021-6052049813636351217业务QQ:1005074258何经理ELISA实验原理、步骤、ELISA问题分析ELISA实验原理酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度类型及步骤ELISA的主要常用类型及步骤1.间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（二抗）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释的样本，保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3）加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。4）加底物显色。2.双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原Z常用的方法，操作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检样本，保温反应。样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。3.双抗原夹心法测抗体反应原理和模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体4.竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，Z后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。ELISAQ&A如何选择合适的阳性对照?阳性对照的基本组成应该尽量与检测样本的组成一致，一般阳性对照多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，加入一定量的待检物质。比如，以人血清为标本的测定，阳性对照多用确定的病人血清或者以复钙人血浆为原料加入一定量标准品。如何选择合适的阴性对照?阴性对照的基本组成也应该尽量与检测样本的组成一致，**先行检测确定其中不含待检物质。比如，检测人血清标本时，阴性对照应该选择正常人血清;检测免疫动物血清中抗体效价时，阴性对照应该选择该动物的免疫前血清。如何选择Zyou化的包被条件?1.包被抗原的选择包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被，对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被（先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上，再通过特异性反应使抗原固相化）。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物，由于分子量太小，往往难于直接吸附在酶标板上，一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联，偶联物吸附于固相载体上。2.包被液的选择一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液，如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话，也可以使用pH7.2的磷酸盐缓冲液。3.包被温度的选择通常是4-8度条件下过夜或者37度保温2小时，我们强烈建议4-8度条件下包被，有利于蛋白活性的保持。4.包被浓度的选择包被的Z适浓度随固相载体和包被物的性质变化，一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml，要明确针对特定包被抗原的Z适包被浓度需要通过实验来确定。包板后需要封闭吗?应该选择什么样的封闭体系?封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中，封闭一般是必不可少的。常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉，AbMART推荐使用5%脱脂奶粉，价廉而且封闭能力强，不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用，不宜长期保存，所以试剂盒中较少使用。如何正确使用酶结合物?1.酶结合物的稀释液在稀释液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%BSA或5%脱脂奶粉），通过竞争YZ酶结合物在固相载体上的非特异性吸附。一般还加入能够YZ蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20（0.05%的浓度较为适宜）。2.正确稀释酶结合物酶结合物的合适工作浓度需要通过预实验来确定，浓度过高易导致本底偏高，浓度过低则会导致阳性信号的减弱。酶结合物**在使用前稀释，稀释后的酶结合物不宜长期保存，因为低浓度的酶结合物极易失活。问题可能的原因解决方法阴性对照产生了阳性的结果试剂或者耗材污染更换试剂，使用一次性耗材洗板出现问题更换更强配方的洗涤液，增加洗板次数，延长洗板时间如果是在双抗体夹心法中出现，有可能是包被抗体与二抗间有交叉反应更换包被抗体或二抗使用了过多的抗体减少抗体使用量整板出现高背景二抗产生了非特异性吸附减少二抗使用量，缩短二抗反应时间显色液不新鲜使用现配的显色液显色反应时间过长没有终止控制显色反应时间，及时终止反应试剂或者耗材污染更换试剂，使用一次性耗材反应温度过高导致的非特异性吸附严格控制反应在Z适温度下进行封闭条件不佳导致的非特异性吸附更换封闭能力更强的封闭液，延长封闭时间反应信号偏低包被条件不合适提高包板浓度，延长包板时间抗原抗体反应不够充分延长反应时间，确保反应在Z适温度下进行显色液配方不恰当增加显色底物的量二抗结合不够提高二抗浓度，延长反应时间，更换效果更好的二抗梯度稀释做ELISA时产生跳孔现象酶标板叠放导致传热不均匀，各孔反应温度有差异尽量避免酶标板叠放在一起移液器稀释时未能保持连续性定期校准移液器，确保移液器的正确使用反应溶液蒸发酶标板用封条密封或者加盖洗板不均匀确定洗板机能够正常工作酶标板底有杂物或者水珠读板时清理干净酶标板底部[详细]

  2018-11-16 10:02

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  进样瓶加样体积[详细]

  2024-09-28 01:08

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  塑料密度计操作步骤详解[详细]

  2015-09-25 00:00

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  纸张透气度测试仪的操作步骤详解：关闭调节溢水阀门，开启加水阀门和透气阀门，将蒸馏水从带漏斗的加水阀门注满容器，关闭加水阀门和透气阀门，将试样夹紧于纸样夹环与空气盒之间，在溢水口下方放置量筒，开启调节溢水阀门，将试区压差调至1kPa（100毫米水柱），如不能达到目的，则可松开锁紧螺栓升降溢水管，直到试区压差为1kPa，待稳定后，启动秒表提取1分钟量筒内水的数量，或量筒内100mL水所需要的时间。由于纸的透气度与恒定压差和测定时间有良好的正比关系，因此必要时可以选择其它测定压差和测定时间，但要在报告中注明。测试前参照表1选择测定透气度所需合适的测试持续时间。选择不同的测试持续时间时，测试结果的读数误差要以不超过2.5%为标准。[详细]

  2018-09-23 10:00

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• ELISA试剂盒实验原理与操作步骤

  上海劲马生物科技有限公司ELISA试剂盒实验原理与操作步骤实验方法：酶联免疫法/酶免法（ELISA）检测原理：采用双抗体夹心ABC-ELISA法操作步骤：具体请参照说明书（详细说明书请联系我司业务人员：021-60517348，13817140470。）注意事项1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间**控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4．请每次测定的同时做标准曲线，**做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔**孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请Z后乘以总稀释倍数（×n×5）。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物请避光保存。7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9．本试剂不同批号组分不得混用。10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。保存条件及有效期1．试剂盒保存：2-8℃2．有效期：6个月[详细]

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  精密陶瓷密度测试仪操作步骤详解[详细]

  2015-09-15 00:00

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  2024-10-03 06:21

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• ELISA实验中常见问题的解决

  ELISA操作常见问题1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。2．试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20～30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。4．加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败Z为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。Z为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。6．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。7．边缘效应使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较ZX孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与ZX孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。8．显色显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白或者非特异性显色增加。9．比色比色要注意波长的选择。以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。其次，单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有Zda吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。Z后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，**是使用双波长比色。综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。操作过程中可能出现的问题和解决方法问题可能原因解决方法显色淡，灵敏度偏低1、试剂盒在运输途中时间太长，温度太高尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温2、试剂盒未充分平衡试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。3、培养箱温度不足37℃注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意4、保温时间不足校正定时钟准确定时5、洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数6、移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，**一次性使用7、蒸馏水水质有问题使用新鲜合格的蒸馏水8、底物作用时间不足准确定时背景深，全部呈有色,1、洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留浓缩洗液准确配制；10倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释；充分洗涤，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染2、样品污染样品应新鲜采集，或低温保存，防止污染3、培养箱温度超过37℃或反应时间过长调整培养箱温度，准确定时4、吸嘴重复使用，未洗净或消毒不彻底吸嘴尽可能一次性使用5、蒸馏水被污染使用新鲜蒸馏水6、酶等试剂混用不同批号试剂勿混用7、一次实验的标本量过多，加样时间太长，导致实际反应时间延长合理安排实验，避免几块酶标板同时加样重复性不佳1、样品数量多少不一，加样时间有长有短重复某一样品时，加样时间尽可能与**次接近2、保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性3、加样量不一致样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴出现白板，阳性对照不显色显色液变质更换新的显色液洗涤液配制有误请按说明书所示稀释倍数配制未加酶结合物而认为已加入注意不要漏加终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用每次加液前均应看清标签[详细]

  2018-09-02 10:00

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• 黄曲霉毒素B1的实验步骤

  Normal07.8磅02falsefalsefalseMicrosoftInternetExplorer4黄曲霉毒素B1的实验步骤、自备物品微孔板酶标仪（含450nm）、振荡器、粉碎机、微量移液器、量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸、氯化钠（分析纯）、甲醇（分析纯）、去离子水或蒸馏水。样品处理取5g粉碎的有代表性的样品，加1.25g氯化捺及250mL70%甲醇溶液，QL振荡3min，用快速定性滤纸过滤。取50μL稀释液进行分析。根据需要可以增加样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加。实验步骤1试剂盒平衡至室温。取所需数量的板条插入微孔架，记录样品及标准的位置。2加入50μL标准品或处理好的样品到微孔，每个标准和样品必须使用新的吸头。3加入50μL抗AFB1单克隆抗体使用液到每个微孔，37℃避光孵育90min。4甩掉空中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，Z后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。5每孔加入酶标物100μL，37℃避光孵育60min。6用洗液洗涤微孔板3min×3次，Z后一次应在吸水纸上拍打已完全除去孔液体。7没空加入显色液100μL（2滴），37℃避光孵育10min。8每孔加入终止液50μL（1滴），立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值（OD）值。测定1目测法：未加终止液前目测。比较样品孔与标准1的微孔颜色，若浅，则为阳性；若深，则为阴性；颜色接近则需用酶标仪测吸光度值比较。2仪器法：用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值。[详细]

  2018-11-15 10:03

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• 石油产品热值检测仪的实验步骤

  汽油热值测定仪试验步骤 1、准备内筒水： 适当调节小筒水温，一般要使小筒水温低于外筒温度1K左右，这样才能到试验终点时内筒比外筒高1K左右，作标定或测发热量做平行样时。 2、准备氧弹 将饶制好的点火丝紧固在氧弹的两个点火电极上，确保接触良好,点火丝的阻值一般取4～6Ω。 3、将小筒小心放入套筒中,把氧弹平稳放入小筒的支脚上，轻轻合上上盖，使上盖上的ZX电极与氧弹弹头良好接触，否则可通过调节ZX电极螺钉露出长度来实现。调节好后，上盖压下时密封圈圆周与方箱上面应均匀接触。 4、选择试验的项目（标定或测量），输入试样数据，开始进行试验。整个试验过程参见上述相关内容。 5、试验结束，屏幕显示试验结果，当打印选项设为“自动”时，还将自动打印输出试验报告。 6、掀起上盖，取出小筒和氧弹将氧弹放气后打开进行清洗，为下一次试验作准备。[详细]

  2020-06-09 19:47

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