RSV疫苗研发的抗原设计及上游工艺技术路线

DSV-Cav1疫苗设计是基于新型疫苗设计技术的典范，是2013年中美科学家联合设计的Pre-F抗原的筛选方法，通过引入半胱氨酸残基稳定在其融合前构象，形成二硫键，从而稳定蛋白质的构象状态。由于稳定的Pre-F是疫苗研发的关键，这部分以Che Y, et al., 2023这篇文章为例，讲述如何构建稳定的Pre-F构象。辉瑞研究团队对来自RSV亚型A的胞外结构域序列进行了计算分析，结果显示应在胞外结构域引入被取代的氨基酸。为了防止Pre-F重排到融合后构象 (Post-F) ，研究者采用了添加二硫键、空腔填充和静电荷突变3种设计策略。

通过3种策略的组合，筛选多个突变体，Z后确认847突变体 (T103C-I148C、S190I、D486S) Z优。如图2，在棉鼠中，构建体847比DS-Cav1、851和852引发更高的抗RSV中和反应。在恒河猴进行两针免疫中，比Post-F免疫组高约50倍的中和抗体滴度，且远高于接种临床剂量Palivizumab（RSV预防性中和抗体药物）免疫的对照组。结果表明847号突变体能稳定在Pre-F构象，且有效诱导实验动物的体液免疫。

数据显示，目前全球在研的RSV疫苗超60款。如表1全球RSV疫苗管线进展，在全球范围内，目前有两款重组RSV疫苗上市，分别是GSK的Arexvy (RSVPreF3/AS01E佐剂) 和Pfizer的无佐剂二价RSV疫苗Abrysvo (RSVPreF) ，这两款均是重组亚单位疫苗。此外，代表mRNA技术路线的Moderna公司的RSV疫苗也预计在2024年上半年获得批准。

国外布局RSV疫苗的企业除了GSK、辉瑞外，还有Moderna、Novavax、赛诺菲、第一三共等。在国内，已有多家企业布局RSV疫苗。其中艾棣维欣处于临床II期，深信生物mRNA RSV刚拿到临床批件，其他疫苗企业，如嘉晨西海、沃森生物/蓝鹊生物、石药集团、艾美疫苗/丽凡达生物等正处于临床前阶段。

减毒活疫苗是指采用病原微生物的自然弱毒株或经培养传代、基因突变等方法减毒处理后获得致病力减弱、免疫原性良好的病原微生物减毒株制成的疫苗。RSV在研的减毒活疫苗有赛诺菲开发的SP0125、Meissa开发的MV-012-968。在宿主细胞的选择中，目前已知的Sanofi的RSV减毒活疫苗工艺上游选择的是Vero细胞。

Vero细胞叫非洲绿猴肾的传代细胞，是贴壁依赖性细胞，常使用细胞工厂培养或使用微载体在生物反应器中培养，以往的培养工艺都需要添加牛血清。而牛血清生产过程复杂，批间差异大，成分难以保持一致，给实验和生产的质量控制带来巨大困难。所以目前Vero细胞的无血清培养工艺逐渐成为一种主流趋势。

有研究人员将无血清培养驯化后的Vero细胞转移至生物反应器内进行微载体扩大培养。该研究采用商业化的Cytodex-1微载体，投料量为10 g/L，成功将Vero细胞在无血清培养体系下细胞密度提高24倍，达到7.2×10⁶ cells/mL（图3），同时保证了细胞的良好状态。

基于CHO细胞表达的重组蛋白疫苗，主要用来表达一些抗原蛋白。CHO细胞一般会构建成稳定的细胞系，构建完成后只需要培养CHO细胞，就可实现外源蛋白的表达，然后从宿主细胞培养上清中分离纯化获取抗原蛋白，再加入佐剂，制成重组蛋白疫苗，如已上市的GSK的Arexvy和Pfizer的无佐剂二价RSV疫苗Abrysvo。

在CHO表达系统中，大多基于成熟的CHO细胞表达工艺，补料批培养Fed-Batch是Z常用的工艺，培养基的选择和培养工艺的优化直接影响重组蛋白的产量。表2是一个提高重组RSV疫苗产量的工艺开发案例的材料与参数。

病毒载体疫苗是指利用基因工程技术将病毒改造为运送外源基因的载体，通过感染细胞将外源基因带入细胞并表达。常用的病毒载体包括改良的痘苗病毒载体、复制缺陷型天花病毒载体、腺病毒 (Adenovirus，Ad) 载体等，可诱导机体产生强烈的体液和细胞免疫应答。RSV在研的一款病毒载体疫苗是Bavarian Nordic公司的MVA-BN-RSV病毒载体疫苗，目前处于临床III期，是基于痘病毒载体的RSV-A/B双价疫苗，且抗原包含了G、F、N和M2共4种蛋白。痘病毒常用的宿主细胞是Vero，基于Vero的微载体贴壁工艺已在减毒活疫苗中介绍，这里就不过多赘述。另一款RSV腺病毒疫苗为美国强生公司基于优化的双突变SC-DM (N67I、S215P) 结构，设计了Ad26.RSV.PreF疫苗。尽管它III期临床终止，但是它稳定的Pre-F结构设计值得学习 (Widjojoatmodjo M N et al., 2015.) 。常用的腺病毒载体有Ad5、Ad26和黑猩猩病毒Y25型。HEK293细胞一般被用来生产腺病毒载体疫苗。

在腺病毒载体疫苗的新型工艺中，批培养和灌流培养是哺乳动物细胞培养和疫苗生产的两种主要策略。前者具有操作简便的优点，而后者具有较高的细胞密度和病毒滴度。因此在腺病毒疫苗的生产工艺中，可采用批培养模式在较低的活细胞密度下，如1×10⁶～2×10⁶ cells/mL进行接毒感染，或者采用灌流策略，达到较高的活细胞密度，如5×10⁶～10×10⁶ cells/mL进行接毒感染，两种工艺均需要对接毒时的活细胞密度TOI、病毒感染复数MOI及收获时间TOH进行摸索。

该案例介绍了一种高效地开发了腺病毒载体带状疱疹 (rAd-HZ) 疫苗生产的无血清HEK293细胞灌流工艺。本文通过使用实验设计 (DoE) 方法，对TOI、MOI和pH进行研究，当TOI为7.2×10⁶ cells/mL，MOI为3.7，pH为7.17时，接毒2 d后收获，rAd-HZ滴度达到3.0×10¹⁰ IFU/mL，如图5所示。

核酸疫苗也叫基因疫苗，是把决定致病原特定抗原的基因遗传物质（DNA或RNA）直接导入人体细胞中，刺激机体产生对该抗原的免疫应答。Moderna是目前第一个布局RSV疫苗且快速进展到临床III期的mRNA疫苗厂商。其mRNA-1345的抗原序列是在DS-Cav1的基础上，增加了A149C&Y458C两个位点突变，使得在DS-Cav1三聚体的单体之间增加额外的二硫键，让三聚体结构更加稳定，从而显著增强疫苗的免疫原性。国内方面，只有深信生物的二价RSV mRNA疫苗IN006获批IND许可，是第二款mRNA RSV获得临床批件的疫苗，其他企业均处于临床前阶段。

DNA疫苗的生产工艺相对简单，包括核酸疫苗的构建、工程菌的发酵、菌体裂解、分离纯化、除菌过滤和制剂6个步骤。而mRNA的制备需要经历大量制备质粒，线性化质粒的制备、RNA体外转录、加帽和纯化再到LNP的包封、制剂几个步骤。相比于其他病毒疫苗，mRNA生产不需要借助细胞，生产速度比其他生物药快的多，并且容易实现标准化和工艺放大。

由于mRNA疫苗工艺在公众号有专门的介绍，这里就不过多赘述。

? RSV Pre-F重组亚单位疫苗的上游工艺开发策略

[1]Che Y,Gribenko A V,Song X,et al.Rational design of a highly immunogenic prefusion-stabilized F glycoprotein antigen for a respiratory syncytial virus vaccine[J].Science Translational Medicine,2023,15(693):eade6422.doi:10.1126/scitranslmed.ade6422.

[2]Widjojoatmodjo M N,Bogaert L,Meek B,et al.Recombinant low-seroprevalent adenoviral vectors Ad26 and Ad35 expressing the respiratory syncytial virus (RSV) fusion protein induce protective immunity against RSV infection in cotton rats[J].Vaccine,2015,33(41):5406-5414. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.08.056.

[3]Sun Y, Huang L, Nie J,et al.Development of a perfusion process for serum-free adenovirus vector herpes zoster vaccine production[J].AMB Express,2022,12(1):1-11,doi.org/10.1186/s13568-022-01398-7.