微流控混合技术制备LNP递送系统的影响因素

自20世纪60年代mRNA首次被发现以来，作为连接基因和蛋白质的桥梁，围绕mRNA的研究就一直在持续。新冠疫情的出现，使mRNA成为炙手可热的研究领域，并加速了该技术的普及和商业化。

mRNA疫苗和药物的技术壁垒在于序列设计和递送载体。序列、递送载体技术的细微差异，对管线临床、上市的节奏影响巨大。递送载体是负责将mRNA成份完整地运送至目标靶点，并且在合适的时机和环境条件下及时释放。同时，递送载体需要经过人体免疫系统的层层保护，容易引起过敏等免疫反应，此外递送载体还很大程度决定了mRNA疫苗和药物的储藏条件和储藏时限。

目前，LNP（脂质纳米颗粒）是应用最广泛的平台，已被证明在mRNA传递方面具有最 佳的临床效果。

LNP主要由可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂组成，目前主流的LNP制备方法是微流控混合技术。

传统的LNP制造方法涉及生产脂质膜，然后使用含核酸的水性缓冲液使膜水融合以被动封装有效载荷。这样得到的产品通常会导致封装产率低，且会掺杂异质颗粒，因此需要添加缩小颗粒尺寸的技术，例如做超声处理等。除此之外，这种方法难以放大并且缺乏可重复性。

因此，21世纪初乙醇注射和微流体技术的发展彻底改变了LNP的制造流程。微流控技术具有良好的稳定性，且易于放大，可重复性高。它涉及通过微混合器将有机溶剂中的脂质与含有核酸的水相混合。阳离子脂质与带负电荷的核酸相互作用，导致高封装效率。通过控制流量比(FRR）或总流量(TFR）等微流体操作参数，可以准确地生产定义尺寸的LNP。使用微流体可以实现高生产速度（TRR)，从而减少制造时间。

微流控混合技术

微流控技术是将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相，将两相溶液注入制备系统的两条入口通道，一端是RNA的水溶液，一端是脂质的乙醇溶液，通过两相的快速混合，完成核酸脂质纳米颗粒的合成。

通过改变流体注入的速度和比率，由此控制脂质纳米颗粒的粒径大小。由于微流控混合技术操作相对简便快速，条件温和，并且容易实现生产放大。

在以往的经验中，通过不同生产规模的微流控机器，可以较好的实现mRNA-LNP的良好制备，其结果一致性良好，粒径结果合适，且具有极低的PDI值，证实其分散性较好，并且包封效果可达90%以上。通过微流控技术的高效、可放大的优势制备核酸脂质纳米粒，每小时可生产20升。

由此引发的如何精确控制LNP的组分、粒度、流量、流体形态等参数，还能确保质量，加快速度，这毫无疑问是个艰难的课题。其中，粒度是对LNP生产较为重要的参数。在微流控技术的实际工艺生产中，需要控制多个参考因素。

总流量和流量比

针对该项技术，有研究表明总流量和流量比会在粒径上影响生产结果，较低的生产速度会形成较大的颗粒，而随着生产速度的提高，颗粒的尺寸会降低。

离子缓冲强度

通过对配方成份和微流体工艺参数对NP的物理化学特性影响的全面研究，测试的阳离子（DDAB 和DOTAP）和可电离（MC3)LNP对微流体操作参数流速比和总流速显示出高灵敏度。交换结构脂质或PEG-脂质导致类似的趋势可以互换。

pH值

低pH值的柠檬酸缓冲液通常用于制备含有可电离/阳离子脂质的RNA-LNP，以减少RNA的碱基水解。

缓冲液的选择和摩尔脂质含量

缓冲液的选择和摩尔脂质含量是LNP制造的重要考虑因素，因为这些会影响LNP的大小和稳定性。除此之外，微流体还允许容纳多种核酸（例如：PolyA、ssDNA、mRMA)。这种优化和配方筛选的方法可用作制备用于基因传递的 LNP 的指南。

值得注意的是，实验室规模台式微流混合设备已经可以通过乙醇-稀释原理，用于空载脂质体或mRNA LNP的生产，且有潜力规模放大至临床或工业化应用。此类微流设备可按良好控制且高通量的方式生产LNP，这无疑可促进用于基因递送的新型LNP的临床转化。除了优化生产过程，新型脂质库的快速筛选也有助于持续优化脂质组成。此外，这也可支持新型离子化脂质的发现，这对于提高mRNA转染的效力和安全性有极大的帮助。

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参考文献：1. Roces CB, Lou G, Jain N, Abraham S, Thomas A, Halbert GW, Perrie Y. Manufacturing Considerations for the Development of Lipid Nanoparticles Using Microfluidics. Pharmaceutics. 2020 Nov 15;12(11):1095. doi: 10.3390/pharmaceutics12111095.PMID: 33203082; PMCID: PMC7697682.

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