一文带你了解干细胞培养全流程

图.干细胞基础研究和临床应用的重大发现和进展的时间轴^【1】

2006年，山中伸弥等科学家把4个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，使其变成多功能干细胞（iPSC），意味着体细胞能够被改造发展成所有类型细胞，开启了干细胞研究的新纪元，于2012年因该项成果发现荣获诺贝尔生理学或医学奖。以“stem cell”作为关键词，在clinicaltrials.gov网站中检索到，截至2024年8月31日全球干细胞临床试验有7253项，其中早期阶段(145)、临床I期(2,448)、II期(3,291)、III期(671)、IV期(166)。目前，国内已批准成立干细胞临床研究备案机构近150余家，通过审批备案的干细胞临床研究已达140余项。干细胞研究已成为重要的方向，接下来小翌将带你了解干细胞的整个培养流程，避免踩坑。

图.用于干细胞治疗的不同细胞来源示意图^【1】

复苏

稀释前将Ceturegel^®基质胶和适量体积的DMEM/F12放入4度冰箱过夜融化。

将融化的Ceturegel^®基质胶和DMEM/F12从冰箱取出并打开盖子，10ml移液管吸吹DMEM/F12几次以冷却移液管，并吸取适量DMEM/F12加入装有Ceturegel^®基质胶的容器中混匀，4度保存，1个月内使用，-20或-80度可保存半年以上。

吸取适量稀释的Ceturegel^®基质胶（货号40190，稀释比例按1：80~1：160，浓度约为10mg/ml为基准）置于6孔板中，轻轻摇晃，使Ceturegel®基质胶均匀平铺于孔板底部，培养箱放置1h以上，种细胞前弃掉，之后每次传代也要先培养器皿内铺胶包被。

将H9（人胚胎干细胞）细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

将冻存管内细胞悬液转移至含3~4ml的H9完全培养液的15ml离心管内，以1000rpm，离心5min。

离心后将上清液吸除，轻弹离心管底，使细胞沉淀松散，加入新鲜的H9完全培养液2~3ml，轻轻吹打一次使细胞克隆块悬浮。

转移至已经铺好Ceturegel^®基质胶的6孔板中培养。

复苏第二天不换液，第三天起每天更换H9细胞完全培养液。

注意：复苏时不能吹打过度，不能吹打成单细胞，保持细胞克隆块状，复苏后48小时换液，期间最好不要挪动细胞。H9复苏后可能4~5天才开始有克隆出现，7-10天传代（具体视克隆密度和大小而定）。

传代

一般在复苏后第7~10天传代，之后常规传代为6-7天一次。

吸除废液。用DPBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

加入2~3ml的1mg/ml的干细胞专用消化液至培养瓶，轻轻晃动，使之覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。

在显微镜下观察，直至克隆脱落（一般需要3~6min）。

将带有脱落克隆的消化液转移至15ml离心管中，放置一会，待克隆自然沉降后将上层吸除，加入H9完全培养液3ml轻轻混匀，放置一会，待克隆自然沉降后将上层培养液吸除，重复一次（即H9完全培养液漂洗2遍，沉降后吸掉上清）。

加入H9完全培养液3ml，用1ml移液器吹打2-3次，将克隆块吹散成大小为原来的约1/10（若想得到大小较均一的克隆块，此时可将细胞静置片刻，待细胞自然沉降后取悬浮于液体中间层的克隆块传代），传代比例根据母瓶克隆密度和大小而定，一般1:3~1:5传代。

放入37℃培养箱内培养。

第二天不换液，第三天起每天换液，换液前显微镜下将分化的克隆挑除。

注意：传代时不能吹打过度，不能吹打成单细胞，保持细胞克隆块状，传代后48小时换液，期间最好不要挪动细胞。每6~7天传代一次。

冻存

按传代的方法将细胞消化下来，漂洗后细胞沉于离心管底部（上述传代中步骤5）。

冷冻比例根据母瓶克隆密度和大小而定，一般1个T25培养瓶可冷冻1-3个冻存管。向离心管内加入1/2冷冻体积的H9完全培养液，轻轻混匀。

逐滴加入已经预冷（4℃）的细胞冻存液，一边加一边轻轻晃动离心管。

1ml移液器轻轻混匀细胞（保持克隆块，不可吹打过度），每支冻存管内加入500ul~lml细胞悬液，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。

将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

图.H9干细胞培养结果示意图

实验相关产品

产品名称	货号	规格
Ceturegel® Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基质胶	40190ES08/10	5/10 mL
NSC-27 supplement, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂	60703ES	10 mL
NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂,去除维生素A	60704ES	10 mL
NSC-27 supplement without Antioxidant, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂,无抗氧化剂	60705ES	10 mL
NSC-27 supplement, serum free, 50X(animal origin-free)无血清 NSC-27 添加剂(非动物源)	60711ES	10 mL
NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X(animal origin-free) 无血清 NSC-27 添加剂,去除维生素A(非动物源）	60712ES	10 mL
N-2 supplement,serum free,100X N-2无血清添加剂，100×	60706ES	5 mL
N-2 supplement,serum free,100X N-2无血清添加剂,100X(非动物源）	60713ES	5 mL
DMEM/F-12 Reduced Serum Medium DMEM/F-12减血清培养基	41420ES76	500 mL

参考文献：

【1】HoangDM , PhamPT , BachTQ , NgoATL , NguyenQT . Stemcellbasedtherapyforhumandiseases . SignalTransductTargetTher . 2022Aug6 ; 7 (1) : 272 .doi : 10.1038 / s41392- 022- 01134- 4 . PMID : 35933430 ; PMCID : PMC9357075.

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