上新 | 快速、高灵敏、低假阳性！支原体巢式PCR试剂盒(2G)来啦~

 支原体（Mycoplasma）又称霉形体，是目前发现的最小、最简单的无细胞壁的原核生物，直径大小0.1~0.3μm，能通过滤膜且呈高度多形性，是哺乳动物细胞培养中相对常见且难以检测的污染物。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。

支原体（mycoplasma）是细菌中最小的一种微生物，在生物学分类中属于柔膜菌门、柔膜菌纲，又分属于不同目科属。其中研究较多的支原体目、支原体科，主要包含支原体属、脲原体属两个种属。

支原体污染对细胞培养造成多方面的不良影响，已经成为在细胞培养时的一个严重问题，保守估计常规细胞培养中支原体污染率为15~35%，严重干扰实验结果的可信度。

细胞培养中95%的支原体污染主要是由莱氏无胆甾原体、精氨酸支原体、口腔支原体、发酵支原体、人型支原体、猪鼻支原体引起的。支原体在培养基上，形成的菌落呈“煎鸡蛋“形状。细胞培养上清和细胞膜适宜支原体生长，寄生在细胞表面的支原体可以穿透宿主细胞膜。

支原体污染来源主要有：细胞培养液或其成分（如培养基原料、血清和其他试剂）、实验室操作人员、细胞培养箱、液氮培养箱、空气中的粒子和气溶胶、抗生素的过度使用、密封不当的细胞培养物和污染了支原体的细胞等。

与此同时，这些污染对应的危害为：导致细胞制品或以细胞为介质进行生产的产品在下游纯化过程中可能因未能有效去除支原体而造成批次报废、污染其接触的所有相关设备设施甚至中间或终产品、导致其他正常细胞受到支原体污染、导致重要细胞或病毒种子库受到支原体污染而报废、导致实验室整体环境受到污染而被迫停止生产或实验操作进行支原体去除、导致支原体产生耐受性而更难以去除、支原体污染面积扩大、对实验室中的其他细胞培养物造成威胁。

图3. 支原体污染的危害

因此，定期进行支原体检测和去除，确保无支原体存在细胞培养体系内才能保障科学研究工作的正常进行。

在生物制药和细胞研究中，支原体污染是一个严重的问题，因为它可能影响实验结果和产品质量。因此，支原体检测对于确保细胞培养物和生物制品的安全性和可靠性至关重要。

目前常用的支原体检测方法包括培养法、PCR（聚合酶链式反应）法、荧光染色法、ELISA（酶联免疫吸附试验）法、qPCR（实时定量PCR）、代谢活性测定（eg. ATP酶法）等。各种支原体检测方法优缺点如下：

表1.不同支原体检测方法对比

合适支原体检测方法的建立，需要考虑检测结果仅用于参考还是用于产品相关样本等的放行，是否符合法规药典要求、是否做了方法验证确认了方法的灵敏度、专属性和耐用性，是否与药典方法可比等。

若涉及产品放行的支原体检测，需使用药典规定方法，即培养法或指示细胞法，或者经验证与药典规定可比的NAT法（如qPCR法，一般验证越早开展越好）。

若不涉及产品放行的支原体检测，即对于日常检测用细胞或者研发早期的细胞等，快速检测支原体的方法作为首选，其中包括巢式PCR法、LAMP等温扩增法、qPCR法、ATP酶法和ELISA法。

基于NAT (nucleic acid amplification techniques)核酸扩增技术，翌圣生物开发了一系列支原体快速检测的试剂盒，包括荧光探针qPCR法支原体检测试剂盒、一步恒温显色法支原体检测试剂盒和巢式PCR法支原体检测试剂盒。

其中，支原体PCR检测试剂盒（巢式PCR）(2G)是基于巢式PCR法(NestedPCR)对各种生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物和动物血清等）支原体感染的检测。该试剂盒采用定量PCR技术，针对支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计两套引物，进行两轮PCR扩增，以第二轮扩增产物为准进行支原体污染情况判断。其可检出包括口腔支原体(M.orale)、肺炎支原体(M.pneumoniae)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、精氨酸支原体(M.arginini)、鸡败血支原体(M.gallisepticum)、关节液支原体(M.synoviae)、发酵支原体(M.fermentans)、柠檬螺原体(Spiroplasma citri)、唾液支原体(M.salivarium)等在内的共34种支原体，灵敏度可达2.5 copies/μL，对于10 CFU/mL支原体标准菌株也可正常扩增有条带，具备特异性强、灵敏度高、操作方便快速等特点，可直接用于细胞培养上清液的检测。

本产品相较于常规PCR法支原体检测试剂盒，可避免由于引物与模板之间的非特异配对，导致非特异性产物的产生；还可灵敏的检测到样本中微量的支原体DNA，避免假阴性的产生。

本产品主要用在日常检测用细胞或者研发早期的细胞的支原体快速检测中。

1、本试剂盒第一轮PCR扩增产物灵敏度为1x10³ copies/μL：

2、本试剂盒第二轮PCR扩增产物灵敏度为2.5 copies/μL：

1、检测范围：本2G版本巢式PCR支原体检测试剂盒检测了中外药典要求的10CFU/mL灵敏度的共8种支原体，均可检出。

PS：药典要求的支原体灭活菌株DNA模板浓度为10CFU/mL，鸡败血支原体、莱氏无胆甾原体由于样本不足未检测

2、样本基质干扰：选取了14种常见样品基质和试剂盒中的阳性对照及其加标（2.5copies/μL阳性对照）、阴性对照（PCR Mix）做验证，14种基质均未检出支原体。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事分子、蛋白和细胞三大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。核心产品覆盖qPCR系列、NGS系列、逆转录系列、核酸提取与纯化系列、PCR系列、分子克隆系列、体外转录系列、抗体、蛋白纯化系列、蛋白分析系列、重组蛋白、细胞分析系列、细胞培养系列、细胞转染系列、报告基因检测系列等多个品类，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。