新品聚焦 | 高内涵成像如何助力肠道类器官毒性研究？

许多药物在药物开发的后期阶段由于不可接受的毒性作用而失败。在临床试验中，药物失败的部分原因是用于筛选药物候选物的预测模型不够完善。而三维 (3D) 类器官显示出可提高体外实验预测准确性的潜力，表明了在临床前测试中使用类器官的潜在价值。

抗癌药物最常见的副作用是其对肠道的毒性，这常常限制了用于治疗患者的药物剂量。利用三维 (3D) 类器官体外实验有助于评估抗癌化合物的毒性效应，并在药物开发过程中提供关键信息。使用自动化高内涵成像可提高检测通量，并扩展关于毒性效应的信息范围，尤其是在涉及复杂的三维生物学模型时。本研究展示了如何利用高内涵成像技术在肠类器官中评估和量化毒性效应。

在本应用说明中，我们介绍了一种用于评估毒性的方法，该方法利用在 Matrigel 胶中培养的三维 (3D) 小鼠肠类器官，测试了 10 种化合物的浓度依赖性表型效应。

按照制造商推荐的操作流程，在??Matrigel?圆顶中使用 IntestiCult 培养基培养 StemCell Technologies 的原代小鼠肠类器官。在类器官培养期间，每 24 小时进行一次自动化培养基更换和透射光成像监测。经过一段时间，类器官自我组织并形成了复杂的隐窝结构，符合肠类器官的表型特征。为了进行毒性评估实验，我们将类器官基质圆顶接种到 96 孔板（Ibidi 板）中，每个圆顶含有 50% 的 Matrigel 基质，体积为 15 μL，大约包含 60 个类器官。类器官通过手动或使用 CellXpress.ai 体外模型自动化工厂进行接种。在培养 48 小时后，向类器官中添加化合物。

除 staurosporine 从 20?μM 浓度开始外，其余化合物从 200 μM 浓度开始进行，采用 4 倍连续稀释，共 7 个浓度。每个稀释步骤将浓度降低到前一个浓度的 25%。此外，对照组用 0.1% DMSO 处理。类器官与化合物共培养 3 天。化合物处理后，类器官用 Hoechst 和 MitoTracker??Orange 染色，然后用 4% 多聚甲醛固定，并在 0.05%??TritonX 存在下用 Alexa488- Phalloidin 进一步染色。所有染料均来自 Thermo Scientific。

类器官使用 ImageXpress HCS.ai 智能高内涵成像分析系统成像，采用共聚焦选项（60??μm 针孔）及 DAPI、FITC、TRITC三个荧光通道，并放大 10 倍。随后，每个孔采集 3×3 个位点的图像，以 10 倍放大倍率覆盖整个类器官圆顶区域。此外，还使用 4 倍放大倍率拍摄了额外的图像。利用 4 张拼接图像覆盖类器官圆顶区域。以 8??μm 间隔拍摄 16 张 Z 层图像，覆盖大约 120 μm 的 Z 轴范围。使用最大投影二维图像进行分析。

对于体积分析，则使用三维Z层图像。

使用 IN??Carta 图像分析进行图像分析。在 IN??Carta 软件中，通过自定义模块编辑器 (Custom Module Editor, CME) 创建了一个多步骤分析 protocol，该 protocol 在投影图像中使用 DAPI 通道（核染色）将类器官定义为斑点。分析最大强度投影图像，测量了类器官的数量、平均类器官面积以及 DAPI（Hoechst 染色）、FITC（Alexa488 鬼笔环肽）和 TRITC (MitoTracker) 的平均类器官荧光强度。首先，使用高斯过滤器对 Hoechst 信号进行模糊处理，以便于对类器官图像进行分割。随后，对细胞核进行分割并用于定义细胞。接着，根据 Phalloidin（肌动蛋白细胞骨架）或 MitoTracker（线粒体）的信号强度，将细胞标记为阳性或阴性。利用对照样本（未处理）和经毒性化合物处理的样本（如 ailuropodine），经验性地设定了阳性和阴性细胞标记的阈值。肌动蛋白阳性或线粒体阳性的细胞分别被定义为具有完整的细胞骨架或完整的线粒体。对每个类器官中的阳性和阴性细胞进行计数，并测量阳性细胞的平均面积和平均强度。将类器官在三维空间中定义为体积对象，并通过自定义模块进行 3D??CME 分析，从而评估类器官的平均体积。分析完成后，根据不同读数的浓度依赖性绘制了四参数曲线拟合图（针对 0.12–200 μM 的浓度范围），以计算化合物毒性效应的 EC50 值。SoftMax Pro 软件用于曲线拟合和 EC50 值的计算。

我们对 10 种化合物进行了毒性效应测试 。西沙必利 (Cisapride) 作为阴性对照，司托罗司 (staurosporine) 作为阳性对照。化合物在0–200??μM的浓度范围内进行了4倍稀释，实验重复两次或三次。毒性评估实验采用96孔板形式进行。类器官培养使用CellXpress.ai体外模型自动化工厂进行设置（详见应用说明《利用健康肠类器官进行化合物毒性效应的自动化测试》），也可手动进行设置。化合物处理3天后，类器官圆顶经固定、染色和成像处理，具体步骤如“材料与方法”所述。类器官成像采用ImageXpress??HCS.ai??智能高内涵成像分析系统，具体方法如“方法”部分所述。

图1展示了经 Hoechst、MitoTracker 和 Phalloidin 染色的肠类器官的最大强度投影图像虽然类器官在大小和复杂性上通常存在差异，但所有完整的类器官均显示出强烈的肌动蛋白信号（绿色），表明细胞骨架完整，以及 MitoTracker 信号（橙 色），表明线粒体完整典型的肠类器官表型特征——肠隐窝也被观察到。图像分析确定了类器官圆顶中的类器官数量，并测量了类器官的大小（面积）以及不同标记物的荧光强度。此外，该分析还识别了单个细胞，并对类器官中的完整细胞和受损细胞进行了计数。

为了量化完整的细胞，我们将肌动蛋白或 MitoTracker 高信号的细胞标记为阳性（即完整）。相反，肌动蛋白或线粒体染色较浅的细胞则被标记为受损或死亡细胞。通过比较阳性样本孔和阴性样本孔，我们经验性地确定了阳性和阴性细胞之间的阈值。随后，我们将这种分析方法应用于整个培养板，包括那些用不同浓度化合物处理过的孔。4 倍放大倍率更适合捕捉整个类器官的表型，而 10 倍放大倍率下更高的核和细胞分辨率则有利于对不同标记物的阳性和阴性细胞数量及百分比进行量化。类器官的密度对于结果的准确性至关重要：较高的密度可以提供更好的统计基础以进行量化，然而，如果接种过于密集，类器官会在图像中重叠，从而导致类器官的分割（检测）不准确。

在我们的研究中，每个孔平均有 60.3±18.2 个类器官。经过化合物处理的类器官表现出显著的表型变化。

图 2 展示了用 10 倍放大倍率拍摄的类器官图像 。类器官的 形 状 变 得 更 加 圆 润 或 塌 陷。化 合 物 浓 度 的 增 加 导 致 Phalloidin 或 MitoTracker 染色减少。

然后，我们选择了以下指标来评估表型变化：每个类器官中肌动蛋白完整的细胞数量（肌动蛋白阳性细胞）；每个类器官中肌动蛋白阴性的细胞数量（受损细胞）；每个类器官中线粒体完整的细胞数量；肌动蛋白阳性细胞的总面积；平均细胞核强度；类器官的平均体积。基于细胞的分析和细胞计数的平均量化（每个类器官和每个孔）在毒性效应的量化中最为高效。这种指标的选择使我们能够量化毒性的不同方面：细胞骨架的解体/细胞死亡，或细胞骨架的塌陷（通过面积评估）；线粒体的完整性，DNA 的完整性（通过 Hoechst 染色评估）通过体积评估来判断生长抑制/类器官塌陷。

我们创建了一条 CME 规则，该规则使用 Hoechst 染色找到类器官，然后定义单个细胞，并使用肌动蛋白和线粒体染色对细胞进行阳性和阴性评分。图 3A 展示了 CME 分析的几个步骤：使用核染料（DAPI 通道）来定义细胞核，使用肌动蛋白染色（FITC 通道）对细胞进行阳性和阴性评分。图 3B 展示了类器官中肌动蛋白阳性和阴性细胞的分析掩膜。图像分析显示了处理样本和未处理样品之间的明显差异，以及浓度依赖性的变化，包括完整细胞（活）或受影响细胞（阴性）的数量、具有完整线粒体的细胞、活细胞面积和细胞核强度。

柱状图（图 4）展示了部分测试化合物的浓度依赖性变化。这些图表也显示了每个类器官中完整细胞（肌动蛋白染色阳性）的平均数量减少，以及受损或死亡细胞（肌动蛋白染色减弱）的数量减少。图 A 显示具有完整细胞骨架的细胞数量。图 B 显示每个类器官中肌动蛋白染色减弱的细胞数量。这种表型与受损或死亡细胞一致。注意，在化合物浓度极高时，这一数字的减少表明细胞显然已经解体，不再被核染色检测到。此外，对于几种 DNA 嵌合剂，尤其是阿霉素和阿糖胞苷，我们观察到核染色的减少。图 C 显示核强度的剂量依赖性降低。我们还检测了每个类器官中具有完整线粒体的细胞数量。随着药物浓度的增加，线粒体阳性细胞的数量减少。我们还使用核染色评估了类器官的平均体积。有趣的是，几种化合物处理以后的类器官平均体积减少，表明这些化合物也抑制了类器官的生长。

分析完成后，将适当读数的数值数据导入曲线拟合软件 (SoftMax Pro) ，确定毒性效应的有效浓度。（也可以使用 Prism 或其他软件进行 EC50 计算）。表 1 中列出了 EC50 值。主要结果可总结如下：除西沙必利外，所有测试的化合物均对肠道类器官产生了毒性效应，这可以通过多种形态学变化得以测量。在观察由肌动蛋白染色测量的细胞骨架完整性时，化合物的效应最为显著。随着化合物浓度的增加，线粒体电位降低，但产生效应的浓度通常高于细胞骨架完整性的浓度，这表明线粒体损伤并非细胞毒性的主要机制。相比之下，DNA 嵌合剂阿霉素、丝裂霉素、顺铂和阿糖胞苷降低了细胞核强度，这与这些化合物的预期作用机制一致。样品经大多数抗癌化合物，尤其是星形菌孢素、阿霉素、丝裂霉素、阿糖胞苷和曲美替尼处理以后，可观察到类器官平均体积的减少，这与抑制细胞增殖一致，显然限制了类器官的生长。

结果表明，处于活跃增殖状态的健康肠道微组织对抗癌药物引起的毒性效应具有易感性，因此可以用于抗癌药物副作用的体外评估。

高内涵成像技术能够测量并量化化合物的多种效应，这些效应反映了不同的表型变化，包括类器官的大小、标记物的强度、完整或受损细胞的计数、细胞核强度或线粒体信号。该方法适用于体外评估药物对健康肠道的毒性效应。根据实验设计，可以使用各种额外的标记物来研究类器官中细胞亚型的其他特定效应。这种方法不仅能够评估细胞死亡表型，还能评估对线粒体、细胞核或细胞增殖的影响。通过增加分析读数的数量并使用统计方法对化合物进行聚类分析，可以进一步增强多参数方法以及对不同读数的同时分析，以发现相似的效果并进一步了解作用机制。

我们开发了一种使用高内涵成像技术（HCS.ai 系统）和 IN Carta 图像分析软件，在 96 孔板中对肠道类器官进行化合物筛选的方法。该工作流程展示了在结合流程自动化和高内涵成像的 protocol 中，如何利用复杂的类器官模型进行化合物测和毒性评估。这些方法能够评估复杂类器官中的多种表型变化，适用于毒性评估研究。

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