免疫组化染色技术（IHC实验）

1.免疫组织化学(IHC) 概念

免疫组织化学(IHC) 是一种利用抗原抗体特异性结合，鉴定组织切片内特定抗原的方法。通过用一种可以被观察到的物质标记抗体，抗体与荧光标记物或酶结合，然后进行比色检测，从而在光学显微镜水平上检测抗原-抗体相互作用。

2.免疫组织化学(IHC) 原理

免疫组织化学是组织细胞中抗原(多肽和蛋白质)的定位、定性和定量研究，利用免疫学的基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性相结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子和同位素)显色。

3.免疫组织化学(IHC)的应用

免疫组织化学 (IHC)，利用单克隆和多克隆抗体检测组织切片中的特定抗原，是诊断性外科病理学家的武器库中非常强大的工具。IHC 是单克隆抗体和多克隆抗体的一项重要应用，可用于确定目标抗原在健康和疾病中的组织分布。

4.卡梅德生物可以提供高质量的免疫组化染色技术服务

卡梅德生物（KMD Bioscience）可以提供高质量的免疫组化染色技术服务，并提供技术支持。免疫组化染色技术的主要流程如下：样品制备，固定，组织切片，石蜡包埋，灭活和阻断，抗原修复，检测。

4.1样品制备

样本采集和制备在 IHC 中起着重要作用，因为抗原的展示和定位在很大程度上取决于组织样本的质量。

4.1.1细胞样本：有贴壁细胞和非贴壁细胞

4.1.2组织样本：组织样本通常取自各种来源的标本：活检、手术、动物模型和尸检。前三种标本提供新鲜组织，而Z后一种（尸检）是在动物死亡两个小时后采集的，这或多或少会死后自溶。

4.2固定

4.2.1固定液的选择

丙酮、酒精、醛、非醛类，需要测试固定液是否适合抗原。

4.2.2方法和时间

（1）浸泡法是活检和手术标本以及其他非冲洗组织通常采用这种固定方法。

（2）灌溉法是动物实验中的一种选择方法

（3）固定时间取决于组织厚度、溶液浓度和实验温度。原则上，时间与组织厚度成正比，与溶液浓度成反比。

4.3组织切片

4.3.1显微载玻片：由于表面附着油污，应将新载玻片浸入清洁液中 12 至 24 小时。用蒸馏水清洗载玻片 5 次以上后，将其浸入 95% 的酒精中 2 小时，然后通过简单擦拭或在红外线烘箱中干燥。洗涤时注意避免划伤载玻片。

4.3.2盖玻片：盖玻片预处理程序与显微镜载玻片非常相似，只是浸渍和清洁可以在 2 小时内完成，因为盖玻片要薄得多。

4.3.3组织切片封片

4.3.3.1用丙酮稀释 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APES)

4.3.3.2用 APES 涂上显微镜载玻片

4.3.3.3在涂层载玻片上涂抹纸巾，然后在纸巾上滴一滴封固剂（甘油明胶）

4.3.3.4将盖玻片保持在 45°，让液滴沿着玻片的边缘扩散

4.3.3.5慢慢地用盖玻片完全覆盖组织

4.3.3.6如果组织切片有粘附问题，将玻片在 80℃ 孵育 1 小时

4.4石蜡包埋

石蜡包埋有五个主要步骤：固定、脱水、透明化、浸渍和包埋。

4.4.1固定：参考如上固定方法

4.4.2脱水：完全去除水分，为下一步创造条件并硬化组织，常用脱水剂是乙醇和丙酮。脱水剂与水完全混溶并且可以与水以不同的体积比制备。

4.4.3透明化：脱水后，组织需要透明化，因为上一步中使用的脱水剂与后续步骤之一的石蜡不混溶。添加透明试剂有助于石蜡吸收到组织中。

4.4.4浸没：透明化后，可将薄纸浸入熔化的石蜡中，使其吸附蜡透明剂。根据蜡的熔点，浸泡应在54-64℃进行。

4.4.5包埋：这是在石蜡盒中处理组织，使石蜡冷却并凝固的过程。以乙醇和二甲苯进行处理。

4.5灭活和阻断

4.5.1灭活

当辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 系统应用于 IHC 时，应阻断或抑制内源性酶的激活，以避免产生非特异性结合。

4.5.1.1内源性 HRP 灭活

（1）将石蜡包埋切片在 3% H2O2 中孵育 10 分钟。

（2）在甲醇和 3% H2O2（v/v：4:1）组成的溶液中孵育冰冻切片或细胞切片 30 分钟。

4.5.1.2内源性 AP 失活

（1）在 0.1 mM 左旋咪唑中孵育样品。

4.5.2阻断

组织切片上的残留位点可能会与二抗结合并产生假阳性结果，因此，通常使用与二抗相同物种的血清进行封闭。

4.6抗原修复

甲醛固定通常会产生亚甲基桥，它会交联蛋白质，从而掩盖目标的表位。必须通过加热（热诱导表位检索：HIER）或酶消化（蛋白水解诱导表位检索：PIER）来暴露抗原表位，以便让抗体结合。

4.7检测

IHC 检测方法因分析报告的性质和结合化学等因素而异。一般使用三种方法：免疫荧光法 (IF)、酶法和亲和法。以荧光法为例介绍实验步骤：

4.7.1免疫荧光法

4.7.1.1初染

（1）将样品贴在载玻片上（为确保荧光染色的有效性，应进行阳性、阴性和样品自发荧光对照，以确认没有非特异性结合。）

（2）加入适当稀释的一抗覆盖样品

（3）将载玻片放入湿盒中，37℃孵育1-2小时

（4）用 0.01 M PBS (pH 7.4) 清洗载玻片 3 次，每次 5 分钟

（5）去除样品上多余的水（但要保持湿润）

（6）用适当稀释的二抗覆盖样品

（7）将载玻片放入湿盒中，37℃孵育30-60分钟

（8）用 0.01 M PBS (pH 7.4) 清洗载玻片 3 次，每次 5 分钟

（9）去除样品上多余的水（但要保持湿润）

（10）向样品中加入缓冲甘油（封固剂）并用盖玻片封固

（11）在荧光显微镜下观察盖玻片

4.7.1.2复染

荧光染色后，应进行复染，使细胞和组织的形态结构清晰，特异性荧光更易观察。常用的复染荧光染料是：DAPI 、Hoechst 3、碘化丙锭。

4.7.2染色样品储存

染色后，样品应立即在荧光显微镜下观察和成像。如果不立即拍摄图像，应将它们安装在缓冲甘油介质中，并在 4℃ 下保存不超过一周。如果将抗荧光衰减介质应用于样品，荧光信号可能不会在一个月内显着衰减。

卡梅德生物是一家提供常规和定制 IHC 和 IF 服务的可靠公司，经验丰富的专家团队做技术支持以解决各类  IHC 和 IF 技术问题，承诺服务质量和速度，以期望达到客户的满意。